基础生物学实验课程课件

1、微生物的观察技术基础生物学实验（三）一、微生物大小的测定目的要求学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法增强微生物细胞大小的感性认识基本原理 微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小、只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺(图-1-c)是一块圆形玻片，其中央刻有精确等分的刻度，有把5毫米刻成为50等分或把10毫米长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同的显微镜放大倍数不同，同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下，其放大倍数也不相同，而目镜测微尺是处在目镜的隔板

2、上，每格实际表示的长度不随显微镜的总放大倍数的放大而放大，仅与目镜的放大倍数有关，只要目镜不变，它就是定值。而显微镜下的细胞物象是经过了物镜、目镜两次放大成象后才进入视野的。即目镜测微尺上刻度的放大比例与显微镜下细胞的放大比例不同，只是代表相对长度，所以使用前须用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求得在一定放大倍数下实际测量时的每格长度。器材菌种 仪器或其他用具 目镜测微尺,镜台测微尺,载玻片,盖玻片,显微镜等.操作步骤镜台测微尺置于载物台上，使刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器、使两尺重叠，再使两尺的“0”刻

3、度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长10微米，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度： 例如目镜测微尺10小格等于血球计数板2小格，已知血球计数板每小格为10微米则2小格的长度为210微米20微米，那么相应地在目镜测微尺上每小格长度为： 同法校正在高倍镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。微米微米210102=*菌体大小的测定先在低倍镜下找到目的物，然后在油镜下转动目镜测微尺，测出苏云金芽孢杆菌菌体的长、宽各占几格(不足一格的部分估计到小数点后一位数)，测出的格数乘上目镜测微尺每格的长度，即

4、等于该菌的大小。一般测量菌的大小要在同一个涂片上测定10-20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小，而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。注意事项当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。观察时光线不宜过强,否则难以找到镜台微尺的刻度;换高倍镜和油镜校正时,务必十分细心,防止接物镜压坏镜台微尺和损坏镜头.二、微生物数量测定微生物计数法直接计数法 稀释平板测数法 光电比浊计数法电子计数器计数法活细胞计数法测定细胞重量法测定细胞总氮量或总碳量颜色改变单位法（colour change unit,简称CCU）显微镜直接计数法 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮

5、液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法，该方法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液。目的要求了解血球计数板的构造；计数原理和计数方法；掌握显微镜下直接计数的技能。常用计菌器常用计数器有血球计数板、Petrof Hausser细菌计菌器以及Hawksley计菌器。两种计数板的原理和部件相同，只是血球计数板较厚，盖玻片和载玻片之间的距离较大，达0.1mm,不能使用油镜观察，只能计数较大的霉菌孢子和酵母菌；而后两种计菌器细菌，盖玻片和载玻片之间的距离只有0.02,可以使用油镜观察，因此可以直接计数细菌。血球计数板结构血球计数板是一块特制的厚型载玻

6、片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每半上面各有一个平台。每个平台上刻有方格网，每个方格网分成9个大方格，中间的大方格就是计数区。计数区计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区容积计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，计数区的高度为0.1mm，盖上盖玻片后每个计数区的体积为0.1mm3。每个小方格的面积为

7、1/400mm2。每个小方格的体积为1/4000mm3。计数方法使用血球计数板计数时，通常数5个中方格中的总菌数A，然后求每个中方格的平均值，再乘上大方格中中方格的数量，就得出一个大方格中的总菌数，再换算成每毫升菌液中微生物细胞的数量。计算：1mL菌液中总菌数=A/5*25*104*B=50000*A*B1mL菌液中总菌数=A/5*16*104*B=32000*A*B其中B为稀释倍数。直接计数法优缺点优点：直观、快速、操作简单。缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；实验器材活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerev

8、isiae）斜面或培养液。器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。实验方法1、用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液（以每个小方格中310个菌为度）。2、取洁净的血球计数板一块，盖上一块盖玻片。3、将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区。4、显微镜计数：将计数板置显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数区，然后换高倍镜计数。5、计数完毕，将血球计数板再水龙头下流水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉淀。注意事项对于出芽的酵母

9、菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。对于压线酵母，按照数上不数下数左不数右的原则计数光电比浊计数法一、目的要求了解光电比浊计数法的原理。学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。光电比浊计数法优缺点优点：简便、快速、连续测定、适合自动化。缺点：光密度受细胞大小、形态、培养液成分以及选用的波长的影响；对于不同微生物的菌悬液要选择相同的菌株和培养条件制作标准曲线；对于颜色太深的样品或含其它具有吸光值的物质不能用此法。二、基本原理当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确

10、测出。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。三、器材菌种 酿酒酵母培养液仪器或其他用具 分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。四、操作步骤标准曲线的制作样品测定标准曲线的制作1、血球计数板直接计数：首先采用血球计数直接计数酿酒酵母菌悬液。2、稀释菌液：将上述已知浓度的酿酒酵母菌悬液分别稀释成为：1106、 2106、 4106、 6106、 8106、 10106、 12106菌/mL的菌悬液。3、测OD值：以无菌生理盐水作为对照，于波长560nm处用1cm比色杯测定上述

11、各菌液的OD值。4、以OD值为纵坐标，每毫升菌数为横坐标，绘制标准曲线。样品测定1、稀释样品：将待测菌悬液用无菌生理盐水适当稀释。2、在560nm波长用1cm比色皿测定稀释后菌悬液的光密度。3、计算：根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数，乘以稀释倍数就得到原液中细菌数。电子计数器计数法电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。计数板结构血球计数板高度0.1mm计菌器高度0.02mm计数区出芽菌计数压线菌计数722型分光光度计操作方法1、按下POWER键，接通电源，按一下RESET键，预热15min。2、开启样品室，用ZERO旋钮调000.0。3、将对照和待测样品加入比色杯，插入比色槽。4、选定测量波长：560nm。5、盖上样品室盖，将空白对照移入光路，调节COARSE SET REF钮，使T值为90.0150.0或A值为0.046 -0.176范围内，按下ADJUST键，调满刻度，即置空白为T值为100或A值为0.00。6、测量样品：将被测样品依次移入光路测量。微生物学实验思考题给一种培养物，请鉴别该微生物属于细菌、