碱性磷酸酶分离提取

1、关于碱性磷酸酶的分离提取第一张，PPT共十九页，创作于2022年6月2碱性磷酸酶 广泛存在于微生物界和动物界。碱性磷酸酶能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。 第二张，PPT共十九页，创作于2022年6月3如何获取碱性磷酸酶 碱性磷酸酶（AKP）溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和其他蛋白分离，从而得到纯化。反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。第三张，PPT共十九页，创作于2022年6月4 1.综合运用有机溶剂沉淀、离心、

2、分光等方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质的技能。2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及鉴定的方法实验目的第四张，PPT共十九页，创作于2022年6月5 实验原理碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二 钠，使之水解生成酚和磷酸盐。酚在碱性溶 液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾 氧化形成红色醌类衍生物，其颜色深浅与 AKP活性成正比。第五张，PPT共十九页，创作于2022年6月6碱性磷酸酶的提取称取兔肝2g,剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入0.01 mol/L的醋酸镁及醋酸钠混合液4ml, 进行匀浆。将其转入离心管，并加2ml 0.01 mol/L的醋酸镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒入离心管

3、，与原来的匀浆液混合。记录体积a，取0.1ml作为A液于EP管，待测比活性用。第六张，PPT共十九页，创作于2022年6月7碱性磷酸酶的提取在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇，玻璃棒搅拌 2min，室温放置30min，纱布过滤，置于离心管。第七张，PPT共十九页，创作于2022年6月8碱性磷酸酶的纯化 滤液加入等体积的冷丙酮，边倒边摇，混匀后3000r/min 5min。弃上清，沉淀用4ml 0.5mol/L Mg(AC)2溶解。记录体积b。取0.1ml作为B液于EP管，待测比活性用。 在悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%（0.46体积），混匀后2000r/min 5min，转移上

4、清液于另一离心管。 上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60%（0.85体积），混匀后3000r/min 5min，沉淀用4ml 0.01M Mg(AC)2、NaAC混合液搅拌混悬。第八张，PPT共十九页，创作于2022年6月9碱性磷酸酶的纯化 其余悬液中缓慢加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数达到33%（0.5体积），混匀后2000r/min 离心5min，取上清液丢弃沉淀。上清液中缓慢加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min。沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶液。作为D液用于比活性测定。第九张，PPT共十九页，创作于202

5、2年6月10第十张，PPT共十九页，创作于2022年6月11碱性磷酸酶活性的鉴定磷酸苯二钠 磷酸盐 + 酚 酚 + 4-氨基安替比林 红色醌类衍生物 AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解磷酸基团。最适pH范围为8.810, 需要镁离子作为激活剂。AKP 铁氰化钾第十一张，PPT共十九页，创作于2022年6月12第十二张，PPT共十九页，创作于2022年6月13 管号 空白 标准 A B C D酶液体 0.1 0.1 0.1 0.1酚标准液 0.1Tris-Mg(AC)2 0.1复合底物 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0第十三张，PPT共十九页，创作于2022年6月14 加入底物后, 立即混匀, 37 准确15 min后加入0.5%铁氰化钾2.0 ml终止反应, 混匀, 静置15 min , 510 nm比色第十四张，PPT共十九页，创作于2022年6月15 酶活性单位（U/ml)=A样A标*0.1*稀释倍数第十五张，PPT共十九页，创作于2022年6月16 蛋白质含量测定基本原理 BCA法第十六张，PPT共十九页，创作于