固相微萃取技术课件

1、固相萃取技术概述 一、固相萃取的原理固相萃取(Solid Phase Extraction,SPE）就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。二、固相萃取的优点(1) 简单、快速和简化了样品预处理操作步骤, 缩短了预处理时间。(2) 处理过的样品易于贮藏、运输 ,便于实验室 间进行质控。(3) 操作条件温和,适应的pH范围广。(4) 不出现乳化现象 ,提高了分离效率。(5) 仅用少量的有机溶剂 ,降低了成本。(6) 易于与其他仪器联用 ,实现自动化在线分析。三、 固相萃取的分类按照选用吸附剂的不

2、同,固相萃取可分为正相固相萃取、反相固相萃取和离子交换固相萃取。 正相固相萃取正相固相萃取所用的吸附剂是极性的，目标化合物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间相互作用，从而使溶解于非极性溶剂中的极性物质在吸附剂表面吸附、富集。其极性作用包括了氢键、-键相互作用、偶极-偶极相互作用和偶极-诱导偶极作用等。 反相固相萃取反相固相萃取所用的吸附剂和目标化合物通常是非极性的或较弱极性的，反相萃取过程中目标物质的碳氢键与吸附剂表面官能团产生非极性作用(包括范德华力或色散力),使得极性溶剂中的非极性以及弱极性的物质在吸附剂表面吸附、富集。离子交换固相萃取离子交换固相萃取又可分为强阳离子固相萃取和强阴离

3、子固相萃取两种,作用机理都是目标物质的带电荷基团同吸附剂表面的带电基团发生离子静电吸引,从而实现吸附分离。 固相萃取的分类按照操作的不同,固相萃取可分为离线萃取和在线萃取。离线萃取是指萃取过程完成后再使用一些分析手段进行分析;在线萃取出现于80年代,萃取和分析同步完成,可靠性、重现性、以及操作性能和工作效率都得到很大程度的提高。四、固相萃取的操作步骤典型的固相萃取一般分为四个基本步骤：1、吸附剂的选择目标物的最佳保留（即最佳吸附）取决于目标物极性与吸附剂极性的相似程度，两者极性越相似，则保留越好（即吸附越好）。选择固相萃取中的固定相吸附剂时，要尽量选择与目标物极性和样品溶剂极性相似的吸附剂。当

4、目标物极性适中时，正、反相固相萃取都可使用。吸附剂的选择还受样品溶剂洗脱强度的制约。在选择固相萃取分离模式和吸附剂时，要考虑以下几点： 目标物在极性或非极性溶剂中的溶解度； 目标物有无可能离子化，从而决定是否采用离子交换固相萃取； 目标物有无可能与吸附剂形成共价键，如果能形成共价键，再洗脱时有可能会遇到麻烦； 非目标物与目标物在吸附剂上的竞争程度，这关系到目标物与干扰化合物能否很好地分离。2、吸附剂的活化 在萃取样品之前要用适当的溶剂淋洗固相萃取柱，使吸附剂保持湿润，有利于吸附剂和目标物质相互作用,提高回收率。 对于正相固相萃取采用的极性吸附剂，通常用目标物所在的有机溶剂（样品基体）进行淋洗；

5、对于反相固相萃取采用的弱极性或非极性吸附剂，通常用水溶性有机溶剂进行淋洗活化。3、上样 将液态或溶解后的固态样品倒入活化后的固相萃取柱，然后利用抽真空，加压或离心的方法使样品流经吸附剂进行吸附。4、洗涤和洗脱先用较弱的溶剂将弱保留的干扰化合物洗掉，再用较强的溶剂将目标物洗脱下来加以收集。方法:真空或离心将淋洗液或洗脱液流过吸附剂在多数情况下，使目标物保留在吸附剂上，最后用强溶剂洗脱，更有利于样品的净化在选择对目标物吸附很弱或不吸附，而对干扰化合物有较强吸附的吸附剂时，可先让目标物淋洗下来加以收集，让干扰化合物保留在吸附剂上，从而实现两者的分离。五、固相萃取应用固相萃取可用于环境化学、食品、医药

6、卫生、临床化学、生物化学、法医学等领域中复杂目标物样品微量或痕量的分离、富集和分析，具有非常广泛的应用。固相微萃取(SolidphaseMicro-ExtractionSPME) 固相微萃取是在固相萃取基础上发展起来的,吸收了固相萃取的优点,摒弃了其需要柱填充物和使用溶剂洗脱解吸附的弊病,只要一支类似进样器的固相微萃取装置即可完成全部前处理,通过色谱进样口提供能量完成解吸附和进样 。优点:萃取、净化、浓缩、进样功能于一体,具有操作简单、所需时间短、无需溶剂、用样量少、选择性强、容易实现自动化以及易于与色谱、电泳等高效分离检测手段联用等与SPE法相比，SPME法具有萃取相用量更少、对待测物的选择

7、性更高、溶质更易洗脱等特点原理SPME的萃取机制就是待测物的样品基质和萃取介质（涂层）间的分配。固相微萃取装置由在微量进样器中插入一段涂有萃取相的石英纤维构成，当萃取达到平衡时，进入萃取相的分析物的量为： N=KfsV1CoV2/（KfsV1+V2）其中，Co为萃取前分析物在样品中的浓度；Kfs为分析物在萃取相和试样间的分配系数； V1 为萃取相的体积；V2为样品的体积。 SPME对有机物的萃取符合“相似相溶”原则，不同的涂层萃取不同的待测物。非极性涂层如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，对非极性物质如烃类效果良好；极性涂层如聚丙烯酸脂(PA)，对极性物质如苯酚和羧酸类的吸附非常有效；但在直接SPM

8、E中，极性涂层如要从水中萃取极性化合物，它对待测物的亲和力必须大于水对待测物的亲和力，否则效果很差。固相微萃取的装置SPME装置略似进样器,典型的SPME装置见右图。特制不锈钢穿透针A为中空结构，纤维固定针B和萃取纤维C能在其中移动，熔融石英纤维C上面涂布用于萃取的固定相，柱塞D控制固定针B的移动使纤维C伸出或退回穿透针中。当纤维暴露在样品中时，涂层可从液态-气态基质中吸附萃取待测物。吸附完毕后，萃取纤维C退回到穿透针中被保护起来，己富集了待测物的纤维可直接转移到仪器(气相色谱仪，液相色谱仪等)进样口，通过仪器进样口的能量解吸附，然后进行分离分析。S P M E 有三种基本的萃取模式：直接萃取

9、（Direct Extraction SPME）顶空萃取(Headspace SPME) 膜保护萃取（membrane-protected SPME）直接萃取（Direct Extraction SPME）直接萃取方法中，涂有萃取固定相的石英纤维被直接插入到样品基质中，目标组分直接从样品基质中转移到萃取固定相中。在实验室操作过程中，常用搅拌方法来加速分析组分从样品基质中扩散到萃取固定相的边缘。对于气体样品而言，气体的自然对流己经足以加速分析组分在两相之间的平衡。但是对于水样品来说，组分在水中的扩散速度要比气体中低3 4 个数量级，因此需要有效的混匀技术来实现样品中组分的快速扩散。 比较常用的混

10、匀技术有：加快样品流速、晃动萃取纤维头或样品容器、转子搅拌及超声混匀。这些混匀技术一方面加速组分在大体积样品基质中的扩散速度，另一方面减小了萃取固定相外壁形成的一层液膜保护鞘而导致的所谓“损耗区域”效应。顶空萃取（HS-SPME） 在顶空萃取模式中，萃取过程可以分为两个步骤：被分析组分从液相中先扩散穿透到气相中；被分析组分从气相转移到萃取固定相中。这种改型可以避免萃取固定相受到某些样品基质（比如人体分泌物或尿液）中高分子物质和不挥发性物质的污染。在该萃取过程中，步骤的萃取速度总体上远远大于步骤的扩散速度，所以步骤成为萃取的控制步骤。因此挥发性组分比半挥发性组分萃取速度快。实际上对于挥发性组分而

11、言，在相同的样品混匀条件下，顶空萃取的平衡时间远远小于直接萃取平衡时间。HS-SPME 法是一个三相萃取体系，即固相(涂层)、液相(样品)、气相。Zhang & Pawliszyn 等研究了HS-SPME 的扩散体系及其平衡，并建立了数学模型： n =C0V1V2K1K2 (K1K2V1+K2V3+V2) 其中，n 为被萃取组分的绝对量，C0 为待测物在样品中的初始浓度，K1、K2 分别是待测物在固相与气相、气相与液相间的分配系数。V1、V2、V3 分别是固相、液相和气相的体积。可见，在涂层类型、萃取时间、萃取温度等操作条件固定的前提下，待测物在萃取涂层中的萃取量与其初始浓度一定范围内成正比。

12、表1 固相微萃取方式的比较Fig.1 SPME Metheds膜保护萃取（membrane-protected SPME）膜保护S P M E 的主要目的是为了在分析很脏的样品时保护萃取固定相避免受到损伤，与H S -SPME 相比，该方法对难挥发性物质组分的萃取富集更为有利。另外，由特殊材料制成的保护膜对萃取过程提供了一定的选择性。固相微萃取过程 固相微萃取在食品分析中的应用已经很广泛，如在挥发性N- 亚硝胺测定中，其操作的一般过程如下：1）固体样品取2.5g 左右，切碎，用一定浓度的NaCl 溶液定容到一定体积后，装入萃取小瓶，利用磁力搅拌器搅拌，或者使用超声波震荡，并同时加热到2550，

13、平衡一段时间后，将老化后的S P M E 针管穿透样品瓶隔垫，插入瓶中。2）推手柄杆使纤维头伸出针管，纤维头置于样品上部空间（顶空方式），萃取时间约15min。3 ）缩回纤维头，然后将针管退出样品瓶。4）萃取完成后，将SPME 针管插入GC 仪进样口，推手柄杆，伸出纤维头，热解析萃取物，进入色谱柱，缩回纤维头，移去针管，完成进样，进行色谱分析。SPME 萃取头的选择依据萃取头是整个SPME 装置的核心，不同固定相所构成的萃取头对物质萃取吸附能力不同。萃取头的选择包括2 个方面，固定相及其厚度的选择。萃取头的选择由欲萃取组分的分配系数、极性、沸点等参数共同确定。一般而言，挥发性越好的样品，需要的

14、薄膜厚度越大，而薄的固定涂膜较适于半挥发性及不挥发性物质。显然厚膜可以萃取更多的物质，可有效吸附高沸点组分，但解吸所需的时间也较长。SPME 在各个领域的广泛应用，促成了涂层材料的多样化和涂层技术的不断发展。到目前为止，已实现商品化的以有机高分子聚合物为涂层材料的探针有：聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷/ 二乙烯基苯、聚乙二醇/ 聚二甲基硅氧烷、C A R / 聚二甲基硅氧烷等。开发更多的复合涂层材料也是当前研究的热点之一。根据所分析物的分子量和极性选择：小分子量或挥发性的化合物通常选用1 0 0 u m P D M S 萃取头；大分子量或挥发性的化合物通常选用30um 或7 u m

15、 P D M S 萃取头；强极性的化合物通常选用85umPA 萃取头；极性挥发性的样品（如乙醇、胺类等）选用65umPDMS/DVB 萃取头。固定相的处理固相微萃取中的关键部位是石英纤维固定相, 靠它来对分析组分吸附和解吸, 如果曾用过但上面的组分未被解吸掉则会对以后的分析结果有干扰。每次使用前必须将其插入气相色谱进样器, 在250左右置1h 以去除上面吸附的干扰物, 如果曾分析过衍生化组分则需要放置更长时间。影响固相微萃取萃取率的因素萃取头的种类及膜厚萃取时间 萃取时间即萃取达到平衡所需的时间由待分析物的分配系数、物质的扩散速率、样品基质、样品体积、萃取头膜厚等因素决定。一般萃取过程均在刚开

16、始时吸附量迅速增加,出现一转折点后上升就很缓慢。因此,可根据实际操作目的对灵敏度的需求不同,适当缩短萃取时间。搅拌和加热 在萃取过程中对样品进行搅拌和加热有助于样品均一化,缩短平衡时间。对顶空固相微萃取( HS - SPME) 加热可提高液面上易挥发有机化合物的浓度,而提高萃取效率。无机盐 向样品中加入(NH4 ) 2SO4 ,Na2SO4 ,NaCl 和K2 CO3等无机盐可降低有机化合物与基质的亲和力而提高萃取效率。p H 缓冲溶液 萃取酸性或碱性物质时,通过调节样品的p H 值可改善组分的亲脂性,从而大大提高萃取效率。固相微萃取(SPME)方法的建立要点SPME方法分为萃取过程和解吸过程

17、两步:（1）萃取过程，将萃取器针头插入样品瓶内，压下手柄，使具有吸附涂层的萃取纤维暴露在样品中进行萃取，经一段时间后，拉起手柄，使萃取纤维缩回到起保护作用的不锈钢针管中，然后拔出针头完成萃取过程。(2)解吸过程，在气相色谱分析中采用热解吸法来解吸萃取物质。将已完成萃取过程的萃取器针头插入气相色谱进样口的气化室内，压下手柄，使萃取纤维暴露在高温载气中，萃取物被解吸下来，进入后序的气相色谱分析。 完成从萃取到分析的整个过程一般只需十几分钟，甚至更快。整个过程实现了无溶剂化，这不但减轻了环境污染，而且还有助于提高气相色谱的柱效，缩短分析时间。由于整个方法的核心是一只携带方便的萃取器，所以特别适于野外

18、的现场取样分析。例如，使用该萃取器可以直接将萃取纤维暴露于空气中，进行大气污染物的测定；直接置于河流、湖泊中进行水质的有机污染物分析。不仅如此，使用固相微萃取法取样后还可以很方便地带回实验室，进行复杂的仪器分析，避免了传统方法中环境样品在运输及保存中的变质与干扰问题。一般来说，顶空SPME法的适用范围较广，尤其是样品复杂且有大分子干扰时更是如此。这时如果采用直接SPME法，干扰物质容易吸附在熔融石英纤维上，影响其吸附性能并在色谱分析中产生不稳基线或杂质峰等。顶空SPME法则避免了上述不良后果，但是当待测物质具有较高的沸点（大约450）时此法耗时长且灵敏度较低，这是由于待测物沸点越高，越难于挥发

19、，因而顶空中待测物的浓度低，难于富集。因此，当样品中待测物沸点较高且有大分子干扰物存在时，上述两种方法都不适合。 3 固相微萃取的特点3.1 SPME技术测定结果准确可靠 采用SPME方法测定水质中的有机化合物，线性范围大、检测限低、并具有较高的灵敏度和回收率。Nour Kayali等人研究了SPME与HPLC联用测定水中痕量二乙基己基邻苯二甲酸酯的方法。结果表明：其标准曲线在10110g/L的范围内均成线性，检测限达0.6g/L。 3.2 SPEM技术操作简单快捷，成本低廉 与传统的预处理方法相比，SPME技术的操作过程显得十分简捷。赵莹雪等采用SPME与气相色谱联用，测定了海水中的甲基膦酸

20、。他们确定了最佳测定方案，从过滤海水开始至 SPME萃取头插入气相色谱进样口，共包括6个步骤，耗时30min。萃取头纤维在气相色谱的进样口解吸时间为3min。最小检测限可达0.5 g/L，测定结果令人满意。3.3 SPME技术可以有效掩蔽样品的基体效应 基体效应是环境样品监测中所面临的不易克服的困难。特别是对于海洋沉积物样品来说更是如此。因此，如何测定复杂介质中某一种物质的浓度，而不使测定结果受到其他因素或物质的影响，是环境监测过程中必需要解决的重要问题。 Fanny Monteil -Rivera等人利用SPME作为沉积物萃取液的纯化技术，得到了9种痕量爆炸物分析的最佳条件，其中包括含硝基的

21、芳香族化合物和三次甲基三硝基胺（RDX）。实验需要在溶液介质中添加高含量的盐（=30）， 以及使用聚乙二醇/二乙烯基苯涂层才能得到最佳的萃取率。沉积物检测限为19gkg（干重）。 3.4 SPME技术可以同时测定多种有机污染物 肖俊峰等采用SPME与GC/MS联用，同时测定了海水中的12种有机氯农药，并对该水域中海产品的食品安全性进行评估。实验结果表明，该方法的检出限达0.27 ng /L，回收率达68133%。Giuseppe Centineo等人使用顶空SPME分析法与GC-MS联用，同时测定了河水和海水 中汞、铅、锡的金属有机物，包括无机汞、甲基汞、三甲基铅、三乙基铅、丁基锡、二丁基锡、

22、三丁基锡等，检测限数量级可精确到ngL，精确度大于90。 4 影响固相微萃取的因素 4.1 纤维表面固定相 选用何种固定相应当综合考虑分析组分在各相中的分配系数、极性与沸点，根据“相似相溶”的原则，选取最适合分析组分的固定相。此外，还需考虑石英纤维表面固定相的体积，即石英纤维长度和涂层膜厚。如非特殊定做，一般石英纤维长度为1cm，膜的厚度通常在10100mm之间，小分子或挥发性物质常用厚膜，大分子或半挥发性物质常用薄膜，综合考虑试样的挥发性还可选择中等厚度。 4.2 萃取时间 萃取时间即萃取达到平衡所需的时间，由待分析物的分配系数、物质的扩散速率、样品基质、样品体积、不同萃取头膜厚和吸附能力以

23、及涂层的物理化学性质等因素决定。一般萃取过程均在刚开始时吸附量迅速增加，出现一转折点后上升就很缓慢。 在分析挥发性有机物时，一般平衡时间较短，10min之内即可达到最高吸附量；而分析复杂基质及半挥发性有机物时，平衡所需时间至少为3060min。因此，可根据实际操作目的对灵敏度的需求不同，适当缩短萃取时间。 4.3 萃取温度SPME提取和富集样品是一个动态平衡的过程，萃取效率与待测物质在各相之间的分配系数有关。分配系数是热力学常数，温度是直接影响分配系数的重要参数。升高温度会促进挥发性化合物到达顶空及萃取纤维表面，然而SPME表面吸附过程一般为放热反应，低温适合于反应进行。综合考虑参数条件，应使

24、萃取介质温度较高，而萃取纤维表面保持低温。4.4 无机盐与萃取pH萃取前于样品中添加无机盐（NaCl、Na2SO4等），水溶液的离子强度增大，有机物的溶解度减小产生盐析，分配系数提高，从而达到增加萃取头固定相对分析组分的吸附，可提高分析的灵敏度。一般添加无机盐适用于顶空方式，对于浸入方式，盐份容易损坏萃取头。另外控制pH值的大小也能改变有机物在水 中的溶解度，通过调节至合适的pH值，可使有机物在水中溶解度减小，从而增大分配系数，提高分析的灵敏度，但是 pH值过高或过低都会影响固定相涂层的使用寿命。 4.5 衍生化反应衍生化反应可用于减小酚、脂肪酸等极性化合物的极性，提高挥发性，增强被固定相吸附

25、的能力。在固相微萃取中，或向试样中直接加入衍生剂，或将衍生剂先附着在石英纤维固定相涂层上，使衍生化反应得以发生。如对短链脂肪酸衍生化常用溴化五氟苯甲烷或重氮化五氟苯乙烷，对长链脂肪酸衍生化常用季铵碱和季铵盐，对短链和长链脂肪酸使用重氨甲烷和芘基重氮甲烷均有效。5 固相微萃取技术的应用5.1 在环境监测方面的应用SPME能准确快速地测定介质中的有机物浓度，监测其形态、结构、分布和运移规律等，从而反映环境质量状况和发展趋势，为环境管理、污染源控制、环境规划等研究提供科学依据。Luis等使用SPME与GC/ ICP/MS联用的方法，分别测定了开放海域、San Lorenzo海滩、造船厂近岸海域以及封

26、闭的码头内海水中甲基汞和无机汞的含量。发现造船厂附近和封闭的码头内海水中甲基汞质量浓度（分别为33.2 ng/L 和 77.0 ng/L）远远高于开放海域和 San Lorenzo海滩（0.390 ng/L 和 4.46 ng/L）；而无机汞的质量浓度最低为3.1 ng/L（开放海域），最高达 129 ng/L（造船厂近岸海域）。测定结果表明，SPME技术的灵敏度较高，不仅可以准确测定水质中污染物的浓度，而且可以测定有机物的存在形式。5.2 在农药残留分析中的应用由单一种类农药多残留分析向多品种农药多残留分析发展，且对农药的代谢物、降解物以及轭合物的残留分析给予更多的关注，已经成为现代农药残留

27、分析方法的发展趋势。作为先进的样品前处理技术SPME在多品种农药的多残留分析过程中，也显示了其不凡的性能。Fedefieo Ferrari 等利用SPME（PDMS）-GCMS检测了喷过农药的温室气体中有机氯、百菌清等多种农药的残留。Anne Scheyer等还利用SPME（PDMS）-GC-ITD-MSMS测定了雨水中包括除草剂在内的20种农药。M.J.Gonza等在经过酸处理的稀释牛奶样品中利用DI-SPME-LP-GC-MSMS同时检测不同类别的农药达40种之多。5.3 在食品方面的应用固相微萃取广泛用于食品风味分析，如水果、蔬菜、调味品等食品中的风味物质的分析。5.3.1 分析水果、蔬

28、菜中的风味物质对果蔬不同阶段的香气成分进行分析，建立香气成分档案，进而可以依据这些资料来确定果蔬的采摘期、贮藏期和货价寿命，改变以前依靠人的感观来判断，为更科学的管理提供了理论依据。顶空固相微萃取（HS-SPME）和GC-MS联用非常适于分析水果的特征香成分的鉴定和分析。陈计峦等用该方法对新疆库尔勒香梨的香气成分进行研究一共分离鉴定出43种化合物。王依春等采用传统的同时蒸馏萃取装置和SPME-GC-MS法并经过实验条件的优化采用85umCARPDMS萃取头测得洋葱含有52种物质，其中硫醇类、硫醚类是洋葱挥发性风味成分的主要贡献物质。5.3.2 分析天然调料中的风味物质分析天然调料种的风味物质，有利于开发新的食品添加剂，改善天然调料的品质，有利于研究天然调料中的活性成分的开发和研究。周晓媛等采用同时蒸馏萃取（SDE）和HS-SPME两种方法提取传统发酵辣椒挥发性成分，通过GC-MS联用仪对挥发性成分进行分离鉴定，共得到了10类56种化合物。5.3.3 分析酒类风味物质组成酒类风味物质中，挥发性香气物质部分来源于原料在生长、成熟 、储藏等工程中形成的香气，部分由于发酵过程中通过酵母菌的代谢作用和后期陈酿而产生的。