Agilent1260高效液相色谱仪确认方案

1、南京健友生化制药股份有限公司NanjingKing-friendBiochemicalPharmaceuticalCo.Ltd安捷伦1260高效液相色谱仪确认方案VerificationProtocolfortheAgilent1260HPLC人员姓名部门签名/日期起草人审核人审核人审核人批准人TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark61.目的32.确认范围3 HYPERLINK l bookmark83.背景3 HYPERLINK l bookmark104.职责3 HYPERLINK l bookmark125.预确认36.运行确认47.性能确认48.偏差与变更

2、109.再确认周期10 HYPERLINK l bookmark2010.参考文献10 HYPERLINK l bookmark2211.历史10 HYPERLINK l bookmark2412.附录101.目的通过建立Agilent1260HPLC的确认方案，以运行确认主要检查Agilent1260HPLC各单元的性能及整机运行是否达到供货单位设计要求；性能确认主要检查Agilent1260HPLC四元泵、进样器、柱温箱、检测器的性能符合设计要求，保证仪器在后续运行检测的准确性。确认范围本方案适用于位于制剂厂区质量管理部三楼仪器室固定资产编号为F02-QC00014的Agilent1260

3、型高效液相液谱仪的确认。背景可变波长检测器(VWD)联用，主要用于实验室日常检测。与示差折光检测器(RID)联用，主要用于依诺肝素钠原料药及注射液等分子量及分子量分布的检测。4.职责确认程序人员责任准备/执行设备确认小组人员起草确认方案、确认报告，完成设备的确认。审核QC审核确认方案、确认报告。工程部审核确认方案、确认报告。QA审核确认方案、确认报告。批准质量负责人批准确认方案和报告。5.预确认参与测试人员培训确认根据确认方案内容涉及的文件、仪器、人员的情况，以检查参与确认方案的人员是否都参加过相关文件、仪器及本方案的培训，记录培训号和相关的培训内容于附录1“测试人员培训记录”中。接受标准：参

4、与仪器确认的人员均应参加过方案涉及的文件、仪器、方案的培训。测试用试剂、试液确认检查确认中使用到的标准品、试剂、计量容器信息，可用于仪器确认。检查内容包括如下：标准品：名称、规格、批号、含量、来源等信息。（自制标准品还应包括复标日期。）试剂：名称、规格、批号、有效期、生产厂家等信息。以上确认信息应详细记录于附录2“测试用试剂液确认”。接受标准：所有使用的物料应在有效期内或可用状态。测试用仪器、仪表确认检查确认中使用到的仪器信息，可用于仪器确认，记录仪器的名称、编号、有效期等信息于附录3“测试用仪器、仪表确认”。接受标准：所有使用到的仪器，如需校验或者计量的，均有在校验或者计量的有效期内。5.4

5、.文件检查确认核查待确认的仪器具有相关的操作文件，IQ/OQ确认前应至少具备使用说明书，PQ确认前应至少具备SOP草案，并将其填写在附录4“待确认仪器相关文件检查”。6.运行确认模块接受标准脱气机连接正常，初始化自检通过四元泵连接正常，初始化自检通过，流动相可流动自动进样器连接正常，初始化自检通过柱温箱连接正常，初始化自检通过VWD检测器连接正常，初始化自检通过RID检测器连接正常，初始化自检通过以上确认信息应详细记录于附录5“Agilent1260HPLC运行确认”。7.性能确认此次性能确认包括如下确认模块：四元泵、自动进样器、柱温箱、VWD检测器、RID检测器；测试项目包括：流速准确度/精

6、密度、梯度混合准确性和波动、进样精密度、进样残留、温度准确性、响应值线性（VWD）、波长准确度（VWD）、基线噪音（VWD）、基线漂移（VWD）、基线噪音（RID）、基线漂移（RID）。模块测试项目测试标准四元泵流速准确度/精密度准确度：5%,RSDS0.50%梯度混合准确性和波动准确度：2%，混合波动0.2%自动进样器进样精密度RSDS1.0%进样残留第1针空白中尼泊金丙酯峰面积与空白后进样的对照溶液b中尼泊金丙酯峰面积的10倍的比值不超过0.5%；对照溶液c中尼泊金丙酯峰面积与空白后进样的对照溶液b中尼泊金丙酯峰面积的比值在0.91.1%之间。柱温箱温度准确性2CVWD检测器响应值线性左0

7、.999波长准确度2nm基线噪音5X10-4AU基线漂移5X10-3AU/30minRID检测器基线噪声2.5x10-9RIU基线漂移V200 x10-9RIU/h7.1四元泵性能确认7.1.1流速准确度/精密度确认在仪器控制界面分别设定流速为1.00mL/min,0.5mL/min,以超纯水为流动相，不安装色谱柱。于废液出口用洁净的10ml容量瓶收集，用秒表开始计时，到容量瓶装满至刻度停止，记录所用的时间。重复测量5次，结果记录于附录6“Agilent1260HPLC性能确认-流速准确度/精密度”。由超纯水体积与时间的比值计算得测量流速，准确度计算公式为：|平均流速-设定流速|准确度=x10

8、0%设定流速接受标准：计算所得结果准确度应在士5%，RSD应0.50%o7.1.2梯度混合准确性和波动确认在仪器控制界面设定流速为1.00mL/min，以超纯水为流动相A，0.5%丙酮为流动相B，不安装色谱柱，检测波长为265nm程序梯度设置如下表，分别对A-B，A-C，B-D通道进行梯度洗脱：时间(min)流动相A的比例（）流动相B的比例（）010000.1901010901010.1505020505020.1109030109030.1010040010040.11000测试前，先用流动相A平衡系统至少10分钟，然后按上述方法和梯度设置运行，记录色谱图。以程序开始B比例为0%时的值为基线

9、值，手动测量出B占整个混合梯度段的10%、50%、90%、100%时对应的高度h（各梯度开始时的高度），计算时以B占100%时的高度为H。结果记录于附录7“Agilent1260HPLC性能确认-梯度混合准确性和波动”。计算公式：式中N：B占50%时梯度时的噪音值，在梯度内选1min计算;h50：B占50%时的高度。接受标准：计算所得结果准确度应在2%,混合波动应0.2%07.2自动进样器性能确认7.2.1进样精密度和残留确认流动相配制：色谱级甲醇与超纯水按体积比6:4混匀，即得60%的甲醇水溶液。样品溶液配制过程：对照溶液a：称取15mg尼泊金丙酯溶于100.00mL流动相中；对照溶液b：吸

10、取1.0mL对照溶液a于流动相中并定容至10.00mL；对照溶液c：吸取1.0mL对照溶液b于流动相中并定容至100.00mL。结果记录于附录8“Agilent1260HPLC性能确认-进样精密度和残留”。仪器设定条件及进样顺序见下表：条件流速1.00mL/min流动相甲醇：水=60：40色谱柱C-8波长254nm进样体积20pL进样顺序进样顺序进样次数对照溶液b6对照溶液a1空白（流动相）1对照溶液b1空白（流动相）1对照溶液C1接受标准：进样精密度：对照溶液b色谱图中所有峰的峰面积，RSD应1.0%0进样残留：第1针空白中尼泊金丙酯峰面积与空白后进样的对照溶液b中尼泊金丙酯峰面积的10倍的

11、比值不超过0.5%；对照溶液c中尼泊金丙酯峰面积与空白后进样的对照溶液b中尼泊金丙酯峰面积的比值在0.91.1%之间。7.3柱温箱性能确认柱温箱温度准确性确认设定柱温箱的温度分别为20C、30C、40C、50C。等待约30min平衡系统，将校正过的多点巡回检测仪（或者校正过的温度计）放入柱温箱，等待10min后，每隔一分钟记录一次柱温箱内左侧、右侧的温度，连续记录10次。实验结果记录于9Agilent1260HPLC性能确认-柱温箱温度准确性”。接受标准：平均值与设定值之差应在士2C。7.4VWD检测器性能确认响应值线性确认（VWD）咖啡因标准溶液配制方法：标准溶液5（50.0口g/mL）：称

12、取9.0mg至11.0mg咖啡因标准品，用色谱级甲醇稀释至200.0mL，混匀。标准溶液4（25.0口g/mL）：取5.0ml标准溶液5,用色谱级甲醇稀释至10.00mL,混匀。标准溶液3（5.0口g/mL）:取1.0ml标准溶液5,用色谱级甲醇稀释至10.00mL，混匀。标准溶液2（1.0口g/mL）:取2.0ml标准溶液3,用色谱级甲醇稀释至10.00mL，混匀。标准溶液1（0.5口g/mL）：取1.0ml标准溶液3,用色谱级甲醇稀释至10.00mL,混匀。仪器设定及进样顺序见下表：条件流速1.00mL/min流动相甲醇色谱柱C-18柱温箱40弋采集时间1min波长273nm进样体积20p

13、L分析时间20min进样顺序进样顺序次数空白（甲醇）2标准11标准21标准31标准41标准51以浓度为横坐标，峰面积作纵坐标，建立线性回归曲线，计算r2值，实验结果记录于附录10“Agilent1260HPLC性能确认-响应值线性（VWD）”。接受标准：r2应大于等于0.999。注：由于此检测中要注入不同浓度，因此也包括了自动进样器样品瓶位置正确性的确认。7.4.2波长准确性确认（VWD）在仪器控制界面设定流速为1.00mL/min,柱温箱温度设为40C,超纯水为流动相，进样体积为20pL，进样时间为1min,按照附录11“Agilent1260HPLC性能确认-波长准确性”设置波长，每次增加

14、1nm,依次进25pg/mL的咖啡因溶液（具体配制见7.4.1响应值线性确认标准溶液4）,记录各个波长处的峰面积，分别记录波长为197nm213nm之间峰面积最大处的波长、237nm253nm之间峰面积最小处的波长、265nm281nm之间峰面积最大处的波长，实验结果记录于附录11“Agilent1200HPLC性能确认-波长准确性（VWD）”。接受标准：标准波长分别为205.0nm，245.0nm,273.0nm，分别计算波长偏差。波长偏差应在2nm。7.4.3基线噪音与基线漂移确认（VWD）选用C18色谱柱，在仪器控制界面设定流速为1.00mL/min，100%甲醇为流动相，波长设定为25

15、4nm，检测灵敏度调到最灵敏档。开机预热，待仪器稳定后记录基线30min，选取基线中噪声最大峰-峰高对应的信号值，按公式计算基线噪声，用检测器自身的物理量（AU）作单位表示。基线漂移用30min内基线偏移起始点最大信号值（AU/30min）表示。实验结果记录于附录12“Agilent1260HPLC性能确认-基线噪音与基线漂移（VWD）”计算公式：Nd=KB式中Nd:检测器基线噪声；K：衰减倍数；B：测得基线峰-峰高对应的信号值，AU。接受标准：噪音应S5X10-4AU,漂移应5X10-3AU/30mino7.5RID检测器性能确认7.5.1基线噪音与基线漂移确认（RID）选用C18色谱柱，在

16、仪器控制界面设定流速为1.00mL/min，100%超纯水为流动相，将仪器各部分连接好（检测器接10mv输出口），接通电源。量程范围选择0.01x10-6RIU,工作站放大倍数为5。启动泵，待基线稳定后记录基线60min。根据检测器衰减的倍数和测得的基线峰高对应的记录仪标度，按下式计算基线噪声和基线漂移。实验结果记录于附录13“Agilent1260HPLC性能确认-基线噪音与基线漂移（RID）”基线噪声=AX0.01X10-610X5基线漂移=BX0.01X10-610X5式中：10检测器输出电压为10mv；5工作站放大倍数；0.01x10-6一为设置量程，RIU；A单一基线波段基线峰高值的

17、变化，mvB基线在60min内偏离原点的值，mv/h。接受标准：基线噪声2.5x10-9RIU,基线漂移V200 x10-9RIU/h。偏差与变更任何偏差和变更都必须按照SMP-VA-1001.R01验证偏差处理单”和SMP-VA-1001.R02“验证变更处理单”进行操作，并按照附录14“偏差和变更汇总”进行总结。再确认周期当仪器正常运行时，规定校验周期为2年，当仪器的安装位置发生变更或仪器更换重要部件时，应及时进行仪器的校验工作，以保证仪器的正常检测。10.参考文献USP(1058)分析仪器的确认2003药品生产验证指南SOP-QC-2003Agilent液相色谱仪使用及维护操作规程QualificationofEquipmentAnnex1:QualificationofHPLCequipmentPA/PH/OMCL(11)0411.历史批准日期修订内容版本2013.03.22新订文件IQOQPQ.022.00见首页增加梯度混合准确性的确认OQPQ.022.0112.附录附录1：测试人员培训记录附录2：测试用试剂液确认附录3：测试用仪器、仪表确认附录4：待确认仪器相关文件检查附录5：Agilent1260HPLC运行确认附录6：Agilent