酶工程复习整理

1、酶工程复习整理酶工程的概念：酶工程又称酶技术，是酶的生产与应用的技术过程，其主要任务是通过人工操作，获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其催化功能。酶工程的发展阶段：1.从动物、植物或微生物细胞和组织中提取酶，加以利用的阶段发酵法生产，揭开近代酶工业的序幕。酶催化作用的机制：邻近效应；底物与底物之间、酶的催化基团与底物之间结合于同一分子，从而使反应速 率大大增加。定向效应：酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取向产生的效应。底物的形变(distortion)和诱导契合(induced fit)：酶中某些基团或离子可以使底物 分子产生“电子张力”，底物分子发生形变，接近过渡态，降低了反应活

2、化能。酸碱催化(acid-base catalysis)：通过瞬时向反应物提供质子或从反应物接受质子以 稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。共价催化(covalent catalysis)：又称亲核催化(nucleophilic catalysis)或亲电 子催化(electrophonic catalysis) 0亲核催化剂(亲电子催化剂)能放出电子(汲取电 子)并作用于底物的缺电子中心(负电中心)，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低 反应活化能。金属离子催化:(1)通过结合底物为反应定向；(2)通过可逆改变金属离子的氧化态调 节氧化还原应；(3)通过静电稳定或屏蔽负电荷。活性部位微环境的

3、影响酶催化反应的特点催化剂的特性：-用量少而催化效率高；-不改变化学反应的平衡点；-参与反应，但在反应前后本身无变化酶催化的特性：高效性(原因)酶可极大程度上降低反应所需的活化能酶催化是多种催化因素的协同作用(邻近效应、定向效应，扭曲变形和构象变化的 催化效应，广义的酸碱催化、共价催化及酶活性中心微环境)专一性反应条件温和酶的活性是受调节控制的专一性的分类：绝对专一性结构专一性酶的专一性族的专一性结构专一性酶的专一性键的专一性光学异构专一性光学异构专一性立体化学专一性几何异构专一性光学异构专一性：当底物具有旋光异构体时，酶只能催化L型和D型两个对映体中的一 个。几何异构专一性：酶能识别顺反异构

4、体。键专一性：酶只要求作用于一定的键，对键两端的基团无要求。基团专一性(族专一性)：除了对键要求以外，还要求键一侧的基团为特定的基团。绝对专一性：对唯一的底物催化唯一的反应。酶活性中心的构成：酶的活性中心(active center)：酶分子上与催化活性直接相关的少数氨基酸残基组成 的催化区域。包括结合部位Binding site:酶分子中与底物结合的部位或区域(结合 部位决定酶的专一性)以及活性中心一催化部位catalytic site：酶分子中促使底物 发生化学变化的部位(催化部位决定酶所催化反应的性质。)酶活性中心有7种氨基酸残基参加的频率最高，它们是Ser、His、Cys、Tyr、As

5、p、Glu、 Lys。双底物酶催化反应的类型：连续机制：反应过程中形成三元配合物，分为序列有序机制：两种底物按一定的顺序与酶结合，只有当第一个酶与底物结合后，第二个 底物才能结合上去。产物也是按照一定的顺序释放。依赖NAD+或NADP+的脱氢酶的反应就 属于这种类型。序列随机机制：两种底物不按一定的顺序结合，产物的释放也是随机的。某些激酶例如肌 酸激酶等就服从随机反应机理。乒乓机制：酶首先和一个底物结合，释放出一个产物以后，再与另一个底物结合，并释放出 产物，不形成三元配合物。转氨酶、某些黄素酶在内的许多酶都具乒乓反应机制酶抑制作用的类型：可逆抑制作用(reversible inhibitio

6、n)：抑制剂与酶以非共价键结合，用透析、超滤 或凝胶过滤等方法可以除去抑制剂，恢复酶活性。不可逆抑制作用(irreversible inhibition)：抑制剂与酶以共价键结合，用上述物理 方法不能除去抑制剂和恢复酶活性。可逆抑制作用 reversible inhibition 类型竞争性抑制作用反竞争性抑制作用非 竞争性抑制作用混合型抑制作用底物浓度增大，反竞争抑制作用减小，竞争抑制作用增强，非竞争抑制作用不受影响 非专一性的不可逆抑制作用不可逆抑制作用非专一性的不可逆抑制作用：抑制剂能和酶上的一类或几类基团反应。专一性不可逆抑制作用：抑制剂只能与酶分子上的酶活性部位有关的基团发生化学反应

7、， 并共价地连接在酶分子的必须基团上，阻碍了底物与酶分子的结合或者破坏了酶的催化基团 的抑制作用。分为两种类型：Ks型专一性不可逆抑制剂（亲和标记）：与底物结构相似，能与酶的底物结合部位结合，同 时还带有一个活性基团，可以和附近的相应基团反应，形成共价键。有结合专一性，但没有 反应专一性。Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物）：既能与活性中心结合，又能被活性中心催化反应，反应 后在抑制剂分子上产生活性基团，再与活性中心的必需基团反应，产生共价修饰。专一性高 酶的生产过程中需要控制的条件以及控制方法需要J工 制的条 件原因控制方法pH与细胞的生长繁殖以及发酵产酶有密切关 系。影响微生物体内各种酶的活

8、性，从而导致 微生物的代谢途径发生改变；影响微生物形态和细胞膜的透性，从而影 响微生物对培养基中的营养成分的吸收和代 谢产物的分泌。影响培养基中某些营养物质的分解或中间 代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物 质的利用。初级调节控制（起始培养基）调 整C/N，调整生理酸性物质与生理 碱性物质之比。补料调节：流加酸/碱，补加碳、 氮源溶解氧调节：控制代谢中间产物 的氧化程度。维持一定的pH值，添加缓冲液温度最适产酶温度低于最适生长温度，在较低温 度下，提高酶的稳定性，延长细胞产酶时间。 有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同 温度条件。微生物代谢产生生物热，除了部分能量以 ATP形式贮存在微生物

9、体内生成菌体和产 物，其余以热的形式散发。夹套，盘管溶氧细胞的生长繁殖以及酶的生物合成过程需要 大量的氧调节通气量。调节氧的分压：富氧增加空气 压力。调节气液接触时间：增加液位高 度，增设档板。调节气液接触面积：提高搅拌速率，空气分布管及其及直径 培养液的特性：粘度、表面张力、 菌体浓度、离子浓度泡沫阻碍CO2的排除，影响氧的溶解；溢罐，导致浪费原料，引起染菌；装液量减少，降低发酵罐的利用率。减少泡沫形成（原料，罐压，搅 拌）机械消泡与化学消泡。消泡剂：天然油脂；高碳醇；脂肪 酸和酯；聚醚；硅酮。酶分离纯化的评价指标:产率=（目的酶的总活力/粗抽提液中目的酶总活力）*100%反映提纯过程酶活力

10、的损 失情况提纯倍数=目的酶的比活力/粗抽提液中目的酶比活力一一提纯方法的效率常用的分离纯化方法：1）根据溶解度：盐析，有机溶剂沉淀法，选择性沉淀法，共沉淀法，PEG沉淀法、等电点 沉淀法2）根据分子大小差异：凝胶过滤，超过滤，离心，超离心3）电学、解离特性差异：吸附，离子交换，电泳（区带、等电聚焦），聚焦层析，疏水层析， 高压层析（HPLC）4）稳定性差异：选择性热变性，选择性酸碱变性，选择性表面变性5）特殊基团差异：亲和层析沉淀 分离 方法分离原理试剂选择影响因素盐析 沉淀 法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下 溶解度不同的特性，通过在酶液中添加 一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液 中析出

11、沉淀，从而使酶与杂质分离硫酸铵最常用（1）pH接近于待纯化酶的等 电点。（2）温度从酶的稳定性和溶解 度看，盐析温度一般 以控制在30C左右为 宜。（3）蛋白质浓度蛋白浓度应在1mg / ml以上等电 点沉 淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最 低，以及不同的两性电解质有不同的等 电点这一特性，通过调节溶液的pH值， 使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质 分离有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解 度不同，通过添加一定量的某种有机溶 剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与 杂质分离丙酮的分离效 果一般最好， 乙醇和甲醇等 也常用。温度操作过程通常应控制在0C以 下。而且有机溶剂必须预先冷

12、却到-1520C。pH尽可能靠近待纯化酶的等电 点pH条件下进行。离子强度添加适当浓度的中性盐，如 510%的硫酸铵，往往有助 于提高分离效果。层析方法分离依据吸附层析吸附剂对不同物质的吸附力不同分配层析各组分在两相中的分配系数不同离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各 种离子的结合力不同凝胶层析利用流动相中各种组分的相对分子质量不同亲和层析利用生物分子与配基之间的专一而又可逆的亲和 力不同层析聚焦两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结 合在一起层析分离是利用混合物中各组分的物理化学性质的不同，使各组分在两相中的分布不同而达到分离。电泳：根据各种蛋白质解离、电学性质上的差

13、异，利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度 不同而进行纯化的一类方法。固定化的方法有哪些载体结合法：将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。根据结合的方式不同，又可分为物理吸附、离子结合和共价结合三种。物理吸附：作用力：氢键、范德华力、疏水键等。吸附剂包括无机吸附 剂(高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等)和有机吸附剂(纤维素、胶原等) 比较受重视。离子结合：通过离子键结合于具有离子交换基团的水不溶性载体的固定化 方法。吸附剂：离子交换纤维素，离子交换葡聚糖，离子交换树脂等。共价结合：通过共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不 溶于水的载体上。包括重氮化法，烷化法。共价交联法：双功能试剂与酶

14、蛋白质中的氨基酸残基作用，使酶与酶之间交联成网，凝集 成固定化酶.常用的是戊二醛包埋法：格子型固定化酶，微型胶囊法固定化酶的哪些性质会发生变化:1对底物的特异性。对低分子底物作用变化不大，而对高分子底物的催化作用明显减弱。是 由于载体的空间位阻引起的。2酶反应最适PH值的改变与载体性质有关3动力学常数的改变。米氏常数和最大反应速度会改变4酶反应温度的改变5增加酶的稳定性。对热、PH值、有机溶媒、蛋白质变性剂、蛋白质分解酶的稳定性增加。 连续化反应稳定性好。一一固定化酶的最大好处评价固定化酶的指标相对活力=固定化酶活力/相同蛋白量的游离酶活力大100%酶结合效率=（加入的总酶活力一未结合的酶活力

15、）/加入的总酶活力大100%酶活力回收率=固定化酶总活力/加入的总酶活力大100%当固定化方法对酶活力没有明显影响时，酶结合效率与酶活力回收率近似。酶修饰的基本方法酶分子侧链基团的化学修饰几种重要的修饰反应：酰化及其相关反应，烷基化反应，氧化和还原反应，芳香环取代反应 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰：巯基，氨基，羧基，分子内交联修饰有机大分子对酶的化学修饰：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精 细的改变，从而改变酶的特性。糖及糖的衍生物，聚乙二醇、大分子多聚物，具有生物活性 的大分子物质（如肝素），漠化氰法、高碘酸氮化法、戊二醛法、叠氮法、琥珀酸法和三氯 均嗪法等蛋白质类及其他

16、化学修饰的基本原理：增强酶天然构象的稳定性与耐热性-酶与修饰剂交联后，使酶的天然构象产生“刚性”，不易伸展打开，从而增强酶的 热稳定性。保护酶活性部位与抗抑制剂-大分子修饰剂与酶共价交联后，其产生的空间障碍或静电斥力能有效地阻挡抑制剂 对酶的进攻，同时“遮盖”保护酶活性部位，使抑制剂和酶结合的难度增加，使酶 的抗抑制剂能力增强。维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶-大分子修饰剂产生的空间障碍可阻挡蛋白水解酶接近酶分子，能“遮盖”酶分子上 敏感键免遭破坏。-酶分子上许多敏感基团参与修饰反应，也减少了酶分子遭受蛋白水解酶攻击破坏的 可能性。消除酶的抗原性-有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成共价键

17、，破坏了酶分子上抗原决定簇的结 构，使酶抗原性降低乃至消除。- 能“遮盖“抗原决定簇和阻碍抗原、抗体产生结合反应。什么是酶分子的定向进化:酶分子的定向进化技术就是人为的创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因 进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因 的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具 有某些特性的进化酶。有机介质中酶催化反应的优点有利于疏水性底物的反应。（主要提高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓度底物连续生物 转化。）可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应。能催化在水中不能进行的反应（有许多难溶于

18、水的非极性底物能够溶于有机溶剂中）有机介质中酶催化反应的条件保证必需水含量：水是保证酶催化反应的必需条件，活性构象是水分子直接或间接由氢键等非共价键 相互作用来维持。必需水：是维系酶构象稳定和酶催化活性所必需的那部分最少量的水分子，有时也 叫结合水，或者束缚水。只要那部分必需水不丢失，其他的大部分水可以由有机溶 剂代替。选择合适的酶及酶形式：酶种类的选择:应具有对抗有机介质变性的潜在能力，在有机介质中能保持其催化活性构象。 酶是否适于在有机介质中反应，除与酶性质有关外，还取决于酶-底物、产物-溶剂间的关系 问题。这完全需要用实验来决定。酶形式的选择酶粉：将酶做成冻干粉，然后在有机介质中充分搅拌

19、，超声波处理，使得 颗粒变小，悬浮于介质中。化学修饰酶：化学修饰可以改变酶的一些理化性质，有利于酶在有机溶剂中的稳定性， 原先不稳定的酶经过修饰变得稳定，主要是因为改变了酶的一些理化性质。选择合适的溶剂及反应体系：水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙腊等。水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等。核酶：核酶的分类1、剪接型核酶剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子（Intron）.剪接型核酶分类I类内含子II类内含子2、剪切型核酶1）、自身催化剪切型RNA 剪切机制这类RNA进行自身催化的反应是只切不接。特点：在Mg 2+或其他二

20、价金属离子存在下，在特定的位点，自我剪切，产生5-OH和2，3-环磷酸二酯末端。2）、异体催化剪切型RNA核糖核酸酶P（RNaseP）是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA 前体的5端，除去多余的序列，形成3-OH和5，-磷酸末端。RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。体外：M1RNA具催化作用，蛋白质作为辅助因子体内：M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的脱氧核酶脱氧核酶催化特征10-23裂解位点为嘌吟、嘧啶连接双链稳定性越高，酶活性越高结合臂的长度影响酶催化转换性 RNA-DNA比RNA-RNA稳定性差。对 Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依赖性组氨酸，精氨酸促进催化活性极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降低切割活性）抗体酶通过生物体免疫系统诱导产生的，具有底物过渡态结合部位的抗体，有很高的催化 活性。抗体酶首先是抗体，具有高度选择性，同时又具有酶提高化学反应速度的性质。抗体酶的催化