生物细胞技术

1、名词解释第二抗体 能够识别一抗的种属特异性，并因此结合一抗，称为二抗（抗种属抗体）0免疫细胞化学技术 是利用免疫化学反应来定位组织细胞中特异大分子的一类技 术。原位杂交技术将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探 针，在组织细胞原位，与细胞内需探测的核酸杂交以检测特异核酸分子的技术， 可以反映特异核酸分子的量，同时也可以反映与组织、细胞、细胞器或染色体结 构的位置关系。原位杂交技术的严谨度决定探针是否与含不相配碱基的核酸序列结合的条件， 是决定杂交双链间形成氢键稳定性的条件，从而最终影响特异性。透射电子 当样品厚度小于100nm时，部分电子可穿透样品，将穿透样品的电子 叫做透射

2、电子。（利用透射电子信息成像的电子显微镜称为透射电镜）二次电子 在入射电子的轰击下，样品表面550nm深度激发出来的电子称为二 次电子。（利用二次电子信息成像的电子显微镜称为扫描电镜）电子显微镜 电子显微镜镜以电子射线作为照明源，以电磁场作为透镜，具有高 分辨率和放大倍率的显微镜。电镜用于研究组织和细胞的超微结构。分辨率表示人眼和光学仪器能够辨别两点之间最小距离的标志。免疫电镜技术 免疫电镜技术是将免疫学方法与电子显微镜技术相结合，利用抗 原与抗体特异结合的特性，在超微结构水平定位特异大分子的技术。si RNA（small interfering RNA）通常为人工合成的长约 20到25个核甘

3、酸的双股 RNA,利用其可与特定信使 RNA （mRNA）发生同源性结合并使之降解的特点， 诱导序列特异的目标基因发生沉默，从而阻断特定基因的表达。具有靶向、高效、 易于操作的特点，是一种研究细胞内基因表达的新技术。增殖指数（PI） PI用来反映月中瘤细胞的增殖能力。PI定义为样品细胞群体中 S 期细胞和G2M细胞之和占总细胞群体的百分比。亚二倍体细胞峰（Sub-G峰）凋亡细胞核小体崩解，DNA含量减少，加之由于 DNA的降解，与荧光染料的结合减少，因此 DNA染料的着色能力下降，荧光强 度降低，表现在FCM测得的细胞核DNA含量分布曲线中，在G1峰左边的低道 数出现一个DNA含量低于G1细胞

4、的分布峰，亚二倍体峰，即亚 G1峰（凋亡峰）。荧光光谱重叠现象当细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时，理论上可选择滤光片使每种荧光仅被相应的通道检测到。 但由于目前使用的各种荧光染 料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射的峰值各不相同， 但发射谱范围有 一定的重叠，因而少量的荧光信号会被另一通道检测到，这种现象就是光谱重叠。（利用荧光补偿解决）荧光补偿 目前使用的荧光素都是宽发射谱的，相互之间有明显的重叠部分。利用电子技术或计算机软件等方法将申入相邻荧光通道的信号加以扣除，这种技术称为荧光补偿。前向散射光FSC细胞前向小角度散射光信号，反映被测细胞的体积大小和活力。 侧向散射光SSC信

5、号方向与激光束和液流形成的平面相垂直，信号强度反应细 胞内部颗粒度和精细结构的变化。（实际工作中常用于外周血样品区分中性粒细 胞与其他白细胞）细胞自发荧光 细胞内物质自身也发出荧光，能被FCM灵敏的检测到，这种未染 色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。简答题简述免疫荧光技术和免疫亲和技术的比较免疫荧光技术将荧光素作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位。免疫亲和技术是利用亲和物质之间高度亲和能力而互相结合，以定位特异分子的技术。（亲和技术优点：灵敏度高，特异性强，稳定性好。根据标记物的不同可用荧光显微镜，光镜，电镜等多种观察方法。）如何在培养细胞

6、水平或临床标本上了解新发现蛋白质的定位？（科学问题：在临床标本上可以发现在某种组织中的哪些细胞上特异存在， 也可 发现在哪种亚细胞器水平上有定位； 在培养细胞上，可发现亚细胞器定位，也可 发现与已知蛋白的相互作用）1）应用免疫胶体金技术，使用针对蛋白质的胶体金标记的单抗，用电镜观察，从而对研究的蛋白质进行亚细胞定位。2）应用免疫荧光共定位技术，对相应的细胞器（如高尔基体、线粒体或内质网等）进行荧光标记，并用可区别于上述荧光的另一种荧光标记蛋白质，用 LSCM 进行观察，即可在蛋白定位的细胞器或区域发现两种荧光。3）应用荧光蛋白技术，将荧光蛋白基因与目的蛋白基因进行重组，使前者在细胞内进行表达，

7、使用荧光显微镜或 LSCM观察，此技术仅适用于培养细胞水平。简述激光共聚焦显微镜的工作原理。在显微镜基础上配置激光光源、扫描装置、共腕聚焦装置和检测系统而形成的新 型荧光显微镜系统。以激光作为激发光源，对样本进行断层扫描，同时采用光源 针孔与检测针孔共腕聚焦技术，最终获得高分辨率光学切片图像的荧光显微镜系 统。简述激光共焦显微镜与荧光显微镜的差别。它有哪些优缺点？光源不同（激光Vs普通光），扫描方式不同（断层扫描 VS一次成像），聚焦不同 （光源针孔+检测针孔双聚焦VS透镜聚焦），图像采集处理不同（计算机采集处理VS目视）优点：高水平及垂直分辨率，可经计算机处理成三维结构。缺点：1.逐点扫描，

8、成像速度慢。2.观测厚度：50-100简述激光共聚焦显微镜的功能。观察标记荧光素的样品：1.薄层断层扫描；2.多通道同时成像；3.ZOOM成像；4.多维度成像；5.荧光定量分析。如果需要了解细胞内部的超微结构变化，请问应选择哪种类型的电镜？透射电镜透射电镜样本取材时必须做到快、小、轻、冷，为什么？快：1分钟内固定，尽可能保持其生活状态，因为瞬间的拖延都会导致细胞超微 结构的变化。小：约1mm3的小块，组织块过大其中央得不到及时固定会发生细胞自溶现象。轻：不要牵拉、锯、挤压组织，避免细胞受到损伤。冷：低温操作，4c保存，降低酶的活性，避免组织发生自溶。没有及时固定的组织细胞透射电镜下会出现何种改

9、变？细胞组织自溶扫描电镜取材必须注意哪些？因为扫描电镜观察的是样品表面结构， 必须充分暴露并保护好观察面，避免损伤 要观察的部位，材料要新鲜，取材部位要准确，样品块要尽量小一些，用锋利的 刀片，尽快固定。气管、胃、肠粘膜可固定在滤纸上展平，要将表面的血液、粘液用生理盐水或缓 冲液仔细漂洗干净。贴壁细胞:进口玻璃盖玻片1cmX1cm，生长细胞，缓冲液漂洗，戊二醛固定1 2小时。游离细胞：玻璃盖玻片表面涂 10%多聚赖氨酸（10分 钟），未完全干燥时涂一 层细胞（10分钟）,戊二醛固定12小时。定量检测几十万个分散的细胞的 DNA含量应用流式细胞检测技术（FCM）.收集单细胞悬液（1 X 106个

10、），缓慢加入1 ml预冷的70%乙醇，于4c固定 过夜，或-20C长期固定。.离心收集细胞，再以1ml PBS彻底洗去乙醇；.去上清后加入染色液（包含 50ug/ml PI, 100ug/ml RNase A 0.2% Triton X-100） 37 C染色30min后上机检测。. DNA荧光染料能与DNA结合，DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比， 荧光强度反应了 DNA吸收荧光分子的多少。通过流式检测就能反映细胞内DNA的含量。看线粒体内外膜结构以及此处的某种蛋白颗粒 看线粒体内外膜结构及蛋白颗粒要用透射电镜。定量检测一批光镜切片上含有某种蛋白质的细胞的数目首先对切片上的全部细胞进行

11、针对目的蛋白的荧光探针特异性标记（荧光染色， 荧光标记抗体，外源导入荧光蛋白），同时对细胞行核复染。再以荧光显微镜或 激光扫描共聚焦显微镜观察。荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关了解细胞发生死亡时的形态学和某个酶的改变 首选以流式细胞术通过对检测细胞以Annexin V/PI双染法或亚二倍体（Sub-G1烽的检测分选出凋亡细胞。再荧光标记凋亡细胞的要检查的酶，以激光扫描共聚焦显微镜观察酶的变化。 对细胞电子染色后以扫描电子显微镜观察其形态。了解某个新基因所编码的蛋白质的功能.首选以Northern blot检测该蛋白在各组织中的表达。 选出表达丰度最高组织细 胞。

12、.设立该组织细胞的cDNA文库，从中筛选出与该蛋白有相互作用的蛋白（编 码基因）。.以酵母双杂交法及GSTpulldown方法对所筛选蛋白做验证。.由所筛选出的蛋白功能来分析推测该蛋白功能并用分子生化技术及细胞生化 技术检测。负显性突变：对影响蛋白质功能的关键位点进行突变， 所得突变体不仅丧失了原 有功能，并且可以抑制内源性蛋白质的功能。DNA microarray:是一种用于分子生物学和医学领域的高通量技术 .它由一系列 成千上万个精微的DNA寡核甘酸点排列而成，这些DNA寡核甘酸含有百亿分之 一摩尔特定序列的。它们或者是一小截基因，或者是 DNA的其他成分。它们被 作为探针，在非常严格的条

13、件下和一个叫做靶分子的 cDNA或cRNA样本杂交。 由于靶分子带有荧光标记，因此通过探针 -靶分子的杂交，并根据杂交后荧光的有或无，强或弱，对靶分子中特定核酸序列的丰度进行检测。共激活因子：是一种蛋白，本身不能与 DNA结合，但能够通过与具有DNA结合 结构域的激活因子（或转录因子）结合来增强基因的表达。共激活因子可调节转 录的许多其他过程，如转录的延长、终止、RNA剪接以及激活因子和共激活因子复合体的降解等。报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达 产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌 合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序

14、列控制下进行表达，从而利用它的 表达产物来标定目的基因的表达调控。si RNA（small interfering RNA）：也被称为短干扰 RNA（short interfering RNA）或沉默 RNA（silencing RNA）通常为人工合成的长约20到25个核甘酸的双股 RNA,利用 其可与特定信使RNA （mRNA）发生同源性结合并使之降解的特点，诱导序列特 异的目标基因发生沉默，从而阻断特定基因的表达。具有靶向、高效、易于操作 的特点，是一种研究细胞内基因表达的新技术。染色质免疫沉淀技术（CHIP :研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的 基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质

15、-DNA复合物，并将其随机切断为一定长 度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目 的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）:是一种研究核酸结合蛋白和其相关的核酸 结合序列相互作用的技术。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和 32P同位素标记的 DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结 合的探针。DNA强白复合物或RNA蛋白复合物比非结合的探针移动得慢。在竞 争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。同 位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同， 可是双链或单链。检测可用纯化蛋白、 部分纯化蛋白或核细胞抽提液。研究蛋白质在细胞内的活动情况需要从哪些方面入手？ 由以下几个方面决定：合成速率：mRNA水平。稳定性：蛋白水平。定位：细胞核、细胞质、细胞器。活性：酶活性：激酶、NADPH氧化酶、组蛋白脱乙酰