打赢“双抗之战”关键要有这两个“武器”

1、打赢“双抗之战”关键要有这两个“武器”展望未来，继续寻找一种完美的双特异性抗体format也许并不现实。怎样充分利用现有（专利已经或将要过期）的 formats 开发出满足自己需要的双特异性抗体药物或许是各大药企面临的最大挑战。同写意活动预告第 70 期复杂注射剂研发创新与一致性评价（ 2018 年 3 月 13-15 日，珠海）第71 期新药项目估值（ 2018 年 3 月 31-4 月 1 日，苏州）第72 期国际通用技术要求下的药品质量研究论坛（2018 年 4 月 21-23 日，苏州）01 双抗的发展史：一、二、三代上世纪70 年代随着杂交瘤技术的出现，人们立即想到能否用同一个抗体来

2、靶向两个不同靶点， 也就是双特异性抗体（ Bispecific Antibody ， bsAb ） 。最早的双特异性抗体大多使用化学偶联的方法，虽然方法简单，但是所得产物复杂不均一，很难用于工业化生产。直到上世纪 80 年代，随着重组DNA 技术的推广，以scFv 为基础的重组双特异性抗体出现并逐渐成为研究重点。第一代双特异性抗体的典型代表就是Amgen/Micromet 的BiTE（Bispecific T-cell Engager），它结构简单，由两个scFv连接而成（图1A） ，但缺点也很明显，就是半衰期短（仅2个小时） ，表达量低。因为半衰期短，所以在临床上不得不使用一个泵持续给药。好

3、在BiTE 的临床给药量低，不到普通抗体用量的十分之一，无形中解决了大量生产的难题。在克服各种困难后，第一个重组双特异性抗体Blinatumomab( CD3-CD19 BiTE ) 终于在 2014 年 12 月获 FDA 批准在美国上市。上世纪 90 年代 Genentech 的 Paul Carter 团队发明了knob-into-hole 结构的双特异性抗体，成为第二代双特异性抗体的典型代表(图1B ) 。第二代双特异性抗体有近似天然IgG 的结构及稳定性，在表达及下游工艺方面也有了很大提高。Roche/Chugai 使用 knob-into-hole 技术的Emicizumab (

4、factor IX and factor X bsAb )于 2017 年 11月获 FDA 批准成为第二个在美国上市的双特异性抗体。目前全球有大约120 种双特异性抗体在不同临床开发阶段，其中不乏所谓的第三代双特异性抗体。究竟哪些可以称得上第三代双特异性抗体，恐怕是仁者见仁智者见智了。笔者认为如果以 T 细胞靶向治疗为例，Roche 的 CEA-TCB (CD3-CEA双特异性抗体) ( 图 1C) 是第三代双特异性抗体的典型代表。因为它不仅利用了第二代双特异性抗体的knob-into-hole 技术，并且Roche 工程师在并购Genentech 后不久发明了CrossMab 技术而成功地

5、解决了knob-into-hole 技术在common light chain 方面的技术瓶颈。此外，CEA-TCB 实现了肿瘤抗原的双价结合( bivalent binding ) 和 CD3 的单价结合( monovalent binding ) ，使得该双特异性抗体能够在结合肿瘤抗原时产生avidity 效果而同时减小CD3 抗体带来的毒性。目前CEA-TCB 已经完成1 期临床并取得令人满意的结果。图 1. 双特异性抗体的几种不同formats02 双抗发展滞后的原因从1986 年首个抗体药物Muromonab （ OKT3 ）获批上市，截至2017 年底， FDA 累 TOC o 1

6、-5 h z 计批准上市了73 个抗体类药物。其中只有以上列举的2 个双特异性抗体。可以看出，双特异性抗体的发展明显滞后于治疗性单克隆抗体。究其原因，不外乎以下几个方面：1 、早期双特异性抗体表达困难，稳定性差，生产工艺复杂；2、双特异性抗体早期研发成本明显高于单克隆抗体。以Emicizumab 为例， Chugai 的科学家们是在筛选了4 万个不同双特异性抗体分子后才确定了成药分子，这当中的付出与坚持恐怕不是一般企业能做得到的；3、双特异性抗体项目立项牵涉到靶点生物学、结构生物学、抗体工程、筛选策略，因此只有具备相当实力的公司才敢涉足也才有可能取得成功。 03 双抗已成各大药企重点布局方向2

7、017 年抗体药物市场容量首次突破千亿美元大关。抗体药物已成为整个制药行业中发展最快的领域之一。而处于抗体药物发展最前沿的双特异性抗体也早已成为全球各大制药企业重点布局的发展方向。 以 Roche 为例， 双特异性抗体已占其大分子药物研发管线的30% 以上（图2） 。随着癌症免疫治疗的持续升温CAR-T 治疗的异军突起，相信双特异性抗体在实体瘤治疗领域将占有相当大的市场份额。相较CAR-T 而言，双特异性抗体药物具有剂量可控、用药周期灵活的优点。同时，双特异性抗体药物还可以针对其它免疫细胞，如NK、Macrophage 等等。图 2. Roche 大分子药物研发管线布局04 研究方向与筛选策略

8、针对双特异性抗体项目立项，笔者认为研发双特异性抗体必须要达到两个单克隆抗体联用无法达到的效果。总结目前双特异性抗体项目的主要研究方向大体可以分为五类：1 、免疫细胞 (尤其是T 细胞) 肿瘤靶向治疗；2、 局部给药 (穿透血脑屏障，关节炎症病灶，眼球)； 3、信号通路协同效应(Synergy) ； 4、利用双靶点增强靶向特异性；5、 利用靶向同一靶点的不同表位(Epitope) 增强内吞(Internalization) 或形成激动剂(Agonist ) 。 一旦确定靶点，接下来的问题就是选择 bsAb formats 。目前文献报道过的各种bsAb formats 在100 种以上，业内推崇

9、的做法是根据专利保护、靶点特性、所要达到的治疗目标而选择2-3 种不同的formats 进行双特异性抗体的构建表达。同时，一个成功的双特异性抗体项目离不开好的筛选策略。与单克隆抗体研发类似，能拿到什么样的双特异性抗体药物取决于采用什么样的筛选方法(Screening Funnel) 。 以 CD3-CEA 双特异性抗体为例，理想化的双特异性抗体药物应该是当且仅当CD3-CEA 双特异性抗体在过表达CEA 的细胞存在时才激活T 细胞。这就需要设计相关的生物学实验来进行筛选。05 常用的抗体工程工具此外，双特异性抗体还要经过一系列严格的成药性(Developability) 实验筛选才能满足后期的

10、工业化生产的要求。往往在筛选过程中很多双特异性抗体拥有生物学功能却不能达到成药性(特别是由于形成聚体aggregates )的要求。在这种情况下就需要进行抗体工程(Antibody Engineering)改造。目前常用的抗体工程工具有以下几种：1 、利用计算模型 (Computational Modeling) 对双特异性抗体的VH/VL(Fv)进行建模，找由并修改 hydrophobic patch 从而改善聚体的形成并提高溶解度(图3A) ； 2、目前大多数双特异性抗体 formats 都包含 (sc)Fv 作为其基本结构单元，而很多时候双特异性抗体的生物活性及成药性取决于(sc)Fv

11、的活性及稳定性；因此可以将scFv 在酵母表面进行展示(YeastDisplay)(图3B)对其进行亲和力及热稳定性的优化；3、有时候双特异性抗体成药性差是由于framework 造成的， 这种情况可以将双特异性抗体的CDRs 嫁接 (CDR grafting) 到已知的成药性好的framework 上(图 3C) 。 在实际研发过程中，往往要将几种不同的抗体工程工具结合使用才能取得较好的结果。图 3. 常用的抗体工程工具06 未来竞争的“核武器”近年来，跨国药企纷纷投入巨资进行双特异性抗体的研发。表现为不仅在内部开发自己的formats 及扩充研发管线，还积极通过技术引进(in licens

12、e )买入其它不同formats (表 1 ) 。 表1. 近两年跨国药企在双特异性抗体技术引进方面的交易以Roche 为例，在已有Knob-into-Hole 、 Crossmab 、 2-in-1的基础上又分别在2014 年及 2017 年从 Dutalys 及Macrogenics 引进不同的双特异性抗体formats 。这是为什么呢？这是因为目前已有的100 多种双特异性抗体formats中没有任何一个是完美的并且适合各种需要。在实际研发过程中， 往往某个单克隆抗体在一种format 上表现很好而在另一种 format 上完全无效。因此最好的策略就是同时使用几种不同的 formats

13、进行双特异性抗体的构建表达及筛选，从中选出最好的分子。这种研发策略已经逐渐在业内取得共识。展望未来，继续寻找一种完美的双特异性抗体format 也许并不现实。怎样充分利用现有(专利已经或将要过期)的formats 开发出满足自己需要的双特异性抗体药物或许是各大药企面临的最大挑战。未来双特异性抗体研发的竞争不会是 format 与 format 的比拼而将是筛选策略以及抗体工程改造方面的竞争。谁掌握了全面的双特异性抗体筛选策略并且拥有完整的双特异性抗体工程改造工具包(tool box) ， 谁就能在未来激烈的双特异性抗体研发竞争中取得领先地位。07 这两项技术或将“独占鳌头”最后，推荐两项有希望

14、在未来双特异性抗体的研发中“独占鳌头”的技术。 一是 Regeneron以及 Merus 这两家公司各自拥有的common light chainhumantransgenic mice 正成为双特异性抗体的生产工厂。单克隆抗体的研发经验告诉我们，从体内得到的抗体往往具有更好的亲和力及成药性。因此，他们拿到的双特异性抗体成功率可能更高而研发周期也随之缩短。值得一提的是，2016年12 月美国 Incyte 公司支付了1.2 亿美金首付款从Merus引进了这项技术。另一项是Adimab 的IgG 酵母展示技术，这使得双特异性抗体建库及细胞筛选成为可能。正因为这项技术的独特性与前瞻性，已经有包括E

15、li Lilly 及 Merck 在内的多家跨国药企出巨资购买了这项技术用于双特异性抗体的研发。这两项技术所产生的双特异性抗体最后能否在临床上取得成功，我们将拭目以待。参考文献：1. BrinkmannU. and Roland RE. The making of bispecific antibodies.MAbs. 2017; 9: 182W122Spiess C et al.,Alternative molecular formats and therapeuticapplications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 2015; 67:95-106.顾津明博士美国波士顿地区Abpro Labs 大分子创