土壤酶的测定方法

1、一、脲酶测定（苯酚钠-次氯酸钠比色法）脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至lOOmL备用。（3）次氯酸钠溶液

2、：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9，溶液稳定。（4）10%尿素溶液：10g尿素溶于lOOmL水中。（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L,则得1mL含O.lmgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。标准曲线绘制：分别取0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5mL氮工作液置于25mL刻度试管中，加蒸馏水至10mL,再加2mL苯酚钠溶液和1.5mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容25mL。1h内再分光光度计上于578nm处比色。管号12345678工作液/ml00.51.52.53.54.55.56.5苯酚钠/

3、ml22222222次氯酸钠/ml1.51.51.51.51.51.51.51.5蒸馏水定容2525252525252525氨态氮量/pg055152535455565A578-100.0540.1480.2630.3390.4330.5140.569A578200.0520.1590.2640.3710.4220.5070.556平均00.0530.1540.2640.3550.4280.511056370605040302010000.20.40.62、操作步骤（1）称取2.5g土置于25mL刻度试管中，加0.5mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15min;往瓶中加入2.5mL10%尿素液和5mL

4、的柠檬酸盐缓冲液（pH6.7）,仔细混匀。在37C恒温箱中培养3h。（当脲酶活性为380微克NH3-N时，本法能获得可靠的结果。若脲酶活性小于3微克，培养时间需增至24h）。（2）然后用热至38C的蒸馏水稀释至刻度（甲苯应浮在刻度以上），摇荡，将悬液过滤。对每一土样，设置用水代替基质的对照。对整个实验，进行无土壤基质的对照，以检验实验的纯度。（3）取滤液0.5mL置于25mL刻度试管中，用蒸馏水稀释至5mL,然后加入2mL苯酚钠溶液，并立即加入1.5mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20min后，将混合物稀释至刻度，（4）在波长578nm处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光

5、值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。3、结果计算以3/24小时后1g土壤中NH3N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure）Ure=aVn/m式中：a为由标准曲线求得的NH3N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）0.5；n为分取倍数50；m为烘干土重（g）2.5注意事项：每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。二过氧化氢酶测定（紫外分光光度法）

6、1.试剂配制0.3%过氧化氢溶液：按1:100将30%H2O2用水稀释1.5N硫酸：取42mL浓硫酸，稀释后定容至500mL0.02N高锰酸钾（1/5KMnO4）溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161g，溶于1升无CO2蒸馏水中，贮于综色瓶中，备用。d.饱和铝钾矶：十二水硫酸铝钾在20C溶解度为10.84g,30C的溶解度为15.41g2.操作步骤（1）取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL0.3%H2O2溶液（现配）。同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL0.3%过氧化氢溶液，而不加土样。将三角瓶放在振荡机上振荡20min后，迅速加入饱和铝钾矶溶液1mL,

7、6000rad离心15min。取上清液9mL加入盛有1mL1.5N硫酸（以稳定未分解的过氧化氢），摇匀后。溶液在240nm处比色，测定吸光度As。同时做无土对照A0和无机质对照Ak。3.结果计算C%V%51x17A0 xV0E=x丁Ae=A0As+AkW，其中，E是土壤过氧化氢酶的活性；T是单位吸光度相当于过氧化氢的克数，A0是无土对照，即空白溶液的吸光度,As是样品溶液的吸光度，Ak是无基质溶液的吸光度C是高锰酸钾的浓度，C=0.02mol/LV是吸取V0mL（10ml）的无土对照即空白溶液用高锰酸钾滴定所消耗的高锰酸钾溶液体积,0.1。W是有效土壤质量。245X9=0.4g数据获取时间：2

8、012-8-22到2012-8-24A01=0.084；三、蔗糖酶测定（比色法）:1、试剂配制（1）3,5二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20mL2N氢氧化钠和50mL水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过7天）。（2）pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（23.876g磷酸氢二钠.12H2O溶于1L蒸馏水中）0.5mL加1/15M磷酸二氢钾（9.078g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中）9.5mL即成。（3）8%蔗糖溶液：80g蔗糖溶于1000mL水中（4）甲苯（5）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖预先在80C烘至恒重。然后取500mg溶于100mL蒸馏水中，即成标准

9、葡萄糖溶液（5mg还原糖/mL）。再将次液稀释10倍制成葡萄糖工作液（0.5mg/mL）。标准曲线绘制：取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5mL葡萄糖工作液，分别注入25mL刻度试管中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。管号12345678工作液/ml00.511.522.533.5DNS/ml1.51.51.51.51.51.51.51.5蒸馏水定容2525252525252525A50800.0510.1750.2840.3850.4900.6100.7162、操作步骤称取5g过1mm筛的风干土，置于50mL三角瓶中

10、，注入15mL8%蔗糖溶液，5mLpH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37C下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液0.5mL，注入25mL刻度试管中，加1.5mL3,5-二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min,随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至25mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。3、结果计算以24h后1g土壤中葡萄糖的质量（mg）表示蔗糖酶活性（Sue）：Suc=aVn/m式中：a为由标准曲线求得的葡萄糖浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土

11、重（g）。4磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法)：土壤磷酸酶是植物根系与微生物的分泌产物。磷酸酶与土壤P素转化密切相关，是土壤P素肥力的指标。1、试剂配制(1)甲苯(2)磷酸笨二钠：称取6.75g磷酸笨二钠(C6H5PO4Na2.2H2O)溶于水，并稀释至1L(1毫升含25mg酚)(3)缓冲液(4)pH9.0硼酸盐缓冲液缓冲溶液配制：(1)酸性磷酸酶:醋酸盐缓冲液(pH=5.0)A：0.2M醋酸钠溶液：16.4g无水醋酸钠(C2H3O2Na)溶于1000mL蒸馏水中，或是27.2g三水醋酸钠(C2H3O2Na.3H2O)溶于1000mL水中。B：0.2M醋酸溶液：11.55mL醋酸定容于1000mL

12、醋酸盐缓冲液(pH=5.0)：7mLA+3mLB混合即得碱性磷酸酶：硼酸盐缓冲液(pH10.0)硼砂一氢氧化钠缓冲液(pHlO.O)：A：硼砂液：19.072g硼砂溶于lOOOmL蒸馏水中B：氢氧化钠溶液：4g氢氧化钠溶于lOOOmL蒸馏水中50mLA+43mLB加水稀释至200mL,混匀即得硼酸盐缓冲液(pH9.0)A：0.05M硼砂溶液：19.07g硼砂(NaBOlOHO)溶于lOOOmL蒸馏水中2472B：O.2M硼酸溶液：12.37g硼酸(H3BO3)溶于lOOOmL蒸馏水中硼酸盐缓冲液(pH9.O)：8OmLA+2OmLB混匀即得（4）中性磷酸酶：柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）A：0.

13、1M柠檬酸溶液：21.01g柠檬酸.H2O（或是19.21gC6H807）溶于lOOOmL蒸馏水中B：0.2M磷酸氢二钠:35.61g磷酸氢二钠.2H2O（53.63g磷酸氢二钠.7屯0或是71.7g磷酸氢二钠.12HO）溶于lOOOmL蒸馏水中2柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）：3.63mLA+16.37mLB混匀即得（5）2.5铁氰化钾（6）0.5的4氨基安替吡啉溶液（7）酚原液：2克酚溶液蒸馏水定容致1升（2mg/mL），溶液在暗色中稳定。（8）酚工作液：取2.5mL原液稀释至100mL（0.05mg酚/mL）磷酸酶测定（磷酸苯二钠比色法）操作步骤：称取2.5g土于25mL容量瓶中，加0.5

14、mL甲苯，加塞塞紧轻摇15min。再加入25mL磷酸苯二钠（6.75g溶于1L水）和2.5mL相应的缓冲液（酸性磷酸酶用pH5.0大醋酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液），同时对每一土样都设置用2.5mL水代替基质的对照。仔细摇匀后放入恒温箱，在37C下培养24h。用热至38C的蒸馏水将容量瓶中混合物稀释至刻度（甲苯浮在刻度以上），再用致密滤纸过滤。取0.25mL滤液于25mL容量瓶中，加1.25mLpH9.0硼酸盐缓冲液，再加入0.75mL2.5%的铁氰化钾和0.75mL0.5%的4氨基安替吡啉溶液，摇动，仔细混匀，这时溶液呈粉红色，然后加水定容。待颜色稳定时（20-30min），在波长570nm处测定各样品的消光值。土壤的磷酸酶活性根据标准曲线求出酚的含量。磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示（若用P的毫克数表示，结果需乘0.32；若用P2O5的毫克数表示，需乘2.29）。标准曲线：分别向100mL容量瓶中注入1，3，5,7,9，11mL工作液并显色定容（分别相当于