trizol法组织DNARNA及蛋白提取方法

1、TRIzol法同时提取RNA、DNA、蛋白质TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNAoTRIzol试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNADNA蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS（溶液均需用DEP

2、C处理过的水配制）。操作步骤：匀浆处理：组织将组织在液氮中磨碎，每50100mg组织加入1mlTRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%o单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。细胞悬液离心收集细胞，每510 x106动物、植物、酵母细胞或1X107细菌细胞加入ImlTRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

3、2将匀浆样品在室温（1530C）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。（我们是5分钟）2-8C10000Xg离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色（我们见到的是红色）有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%o把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇（加入移出液相等体积），室温放置10分钟。28C10000Xg离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管

4、底出现胶状沉淀。移去上清。8.用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1mlTRIzol至少加1ml75%乙醇。28C不超过7500Xg离心5分钟，弃上清。9室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾510分钟即可不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25200M无RNase的水或0.5%SDS,用枪头吸打几次，5560C放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解，-70C保存。预防RNase污染注意事项：1经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。2使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

5、RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150C烘烤4小时，塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01%v/v,放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。注意事项：从少量样品（110mg组织或102104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加510ugRNase-free糖原。糖原会与

6、RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70C保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75%酒精中28C星期以上或-5至-20C年以上。分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600Xg离心3060分钟。预期产量：1mg组织或1X106细胞提取RNA分别为：肝和脾610ug，肾34ug,骨骼肌和脑组织11.5ug，胎盘14ug，上皮细胞815ug，成纤维细胞57ug。常见问题分析：得率低：样品裂解或匀浆处理不彻底。RNA沉淀未完全溶解。A260/A2801.65：检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。

7、低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高。样品匀浆时加的试剂量太少。匀浆样品时未在室温放置5分钟。吸取水相时混入了有机相。RNA沉淀未完全溶解。RNA降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。待提取RNA的样品没有保存于-60至-70C,而保存在了-5至-20C。细胞在用胰酶处理时过度。溶液或离心管未经RNase去除处理。电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5。DNA污染：样品匀浆时加的试剂量太少。样品中含有有机溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。蛋白聚糖和多糖污染：沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1mlTRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶

8、液（0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl）混合离心，按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。DNA的分离准备试剂：乙醇0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）、75%乙醇、8mMNaOH操作步骤：样品加氯仿分层后，移去上层水相，用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用lmlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，28C不超过2000Xg离心5分钟。移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml柠檬酸钠

9、，室温放置30分钟，28C2000Xg离心5分钟，弃上清，重复一次。可以再重复一次。用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1mlTRIzol加入1.52ml75%乙醇，室温放置1020分钟（不时颠倒混合）28C2000Xg离心5分钟，弃上清。室温放置晾干DNA515分钟，用8mMNaOH溶解DNA。从5070mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300600ul8mMNaOH，DNA的浓度通常为0.20.3ug/ul。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaOH的pH值为9,溶解DNA后可用TE，HEPES调节pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含

10、一些胶状不溶物可12000Xg离心10分钟除去。DNA的定量：取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50ug/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人、大鼠、小鼠、1X106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1ug，6.5ug，5.8ugo预期产量：1mg组织或1X106细胞提取DNA分别为肝和肾34ug骨骼肌，脑组织，胎盘23ug人，大鼠，小鼠培养细胞（1X106）57ug成纤维细胞57ug。应用：用于PCR溶于8mMNaOH的DNA用0.1MHEPES调pH至&4,取0.11ugDNA用作模板。酶切反应用HEPES或1mMEDTA调节pH至适当值。每u

11、gDNA使用35单位的酶，8090%的DNA是可消化的。1ml8mMNaOH溶解的DNA样品pH值调节FinalpH0.1MHEPES（ul）FinalpH1MHEPES（ul）8.4867.2238.2937.0328.01017.81177.5159、.，Y-、八.，I/r-.Tr注意事项：DNA在中间层和有机相中时可在28C保存过夜。DNA沉淀在75%乙醇中28C可保存几个月。DNA在8mMNaOH溶液中4C可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至78并且加EDTA至ImM,可置于4C或-20C长期保存。常见问题分析：得率低：样品匀浆和裂解的不彻底。最终得到的DNA沉淀没有完全溶解

12、。A260/A2801.70：检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。酚除去的不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。DNA降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。待提取RNA的样品没有保存于-60至-70C，而保存在了-5至-20C。样品匀浆时使用了高速匀浆仪。RNA污染：氯仿分层后水相去除的不干净。DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）洗的不彻底。蛋白质的提取准备试剂：异丙醇、含0.3M盐酸胍的95%乙醇、无水乙醇、1%SDS。操作步骤：1取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1mlTRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，28C

13、12000Xg离心10分钟弃上清。用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，28C7500Xg离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。3真空抽干蛋白质沉淀510分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50C温浴使其完全溶解，不溶物28C10000Xg离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于WesternBlot或-5至-20C保存备用。注意事项：蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中28C个月以上或-5至-20C一年以上。用0.1%SDS在28C透析三次，10000Xg离心10分钟取上

14、清即可用于WesternBlot。常见问题分析：得率低：样品裂解或匀浆处理不彻底。最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。操作步骤：用Trizol试剂匀浆细胞和组织的方法同RNA提取步骤。在细胞匀浆中加入氯仿，每1mlTrizol的起始用量加入0.2ml氯仿。剧烈震荡30秒钟后室温放置23分钟。4C下10,000g离心10分钟。小心吸取并丢弃上层水相（该水相中富含细胞总RNA，如果需要提取RNA，则收集该水相）。在剩下的中间层及有机相中加入无水乙醇，每1ml起始Trizol用量加入0.3ml无水乙醇。颠倒充分混匀后室温放置

15、23分钟。4C下2,000g离心5分钟。小心吸取并收集上层的酚醇有机相（沉淀为DNA），转移到一个新的离心管中，加入异丙醇，每1ml起始Trizol用量加入1.5ml异丙醇。轻轻混匀后室温放置10分钟。4C下12,000g离心10分钟。丢弃上层液相，沉淀即为蛋白质。用清洗液（盐酸胍溶于95%乙醇中，终浓度为0.3M）清洗沉淀3次。每1ml起始Trizol用量加入2ml清洗液清洗。在每次清洗过程中，先将沉淀保留于清洗液中20分钟（室温下），然后在4C下7,500g离心5分钟。最后一次清洗后，丢弃上层液相，将沉淀悬浮于2ml乙醇中，涡旋震荡15秒后在室温下放置20分钟，然后在4C下7,500g离心5分钟。丢弃上层液相，将沉淀真空干燥510分钟。然后将沉淀溶解于1%SDS（十二烷基硫酸钠）中。可于50C水浴中用tip头反复吹打以助溶。不溶物在4C下10,000g离心10分钟去除。收集上清，转移到新的收集管中。该上清中的蛋白样品可直接用于WesternBlotting实验或保存于-20C。2附注：蛋白沉淀保存于清洗液（盐酸胍溶于95%乙醇中，终浓度为0.3M）中，或保存