乳腺癌与导管内增生性病变免疫组织化学研究及预后评估应用

1、PAGE PAGE 7乳腺癌与导管内增生性病变免疫组织化学研究及预后评估应用*王刚平基金项目：济宁医学院科研计划重点项目（JY2013KJ051）、山东省医药卫生科技发展计划项目课题（2014WS0282， HYPERLINK 7/MSTMIS/WS/ProjectApplication/DownLoadWSProjectFileContent.aspx?ProjectId=A555D7342D4B8D36A677C579E3AF18CC o 下载申报书 t _blank 2014WSA11003）、日照市应用技术研究与开发计划项目（2014SZSH002） 梁云爱1 张作峰1 张红1 潘光晔

2、2（1济宁医学院附属日照市人民医院，山东 日照 276826；2潍坊医学院，山东 潍坊 261042）【摘要】 目的 探讨免疫组织化学在乳腺癌及导管内增生性病变鉴别诊断及预后评估中的应用。方法 检测60例乳腺普通导管增生（UDH）、57例非典型导管增生（ADH）、89例导管原位癌（DCIS）和128例浸润性导管癌（IDC）中抗体ADH-5、CK5/6、CD10、P63、HHF-35、Survivin和VEGF的表达，及其与临床病理因素的关系。结果 管周肌上皮P63和CD10间断性阳性、HHF-35非特异阳性；管内CK5/6呈马赛克样、ER呈斑片状散在阳性；ADH-5鉴别UDH、ADH和DCIS

3、及IDC达100%。（2）Survivin和VEGF的表达，ADH、DCIS和IDC组与UDH组比较差异均有统计学意义（P0.05）。DCIS与IDC、ADH与IDC比较，VEGF表达差异有统计学意义（0.05）；DCIS与ADH组比较，Survivin和VEGF均无统计学意义（P0.05）。Survivin和VEGF高表达与乳腺癌分级、分期和转移有关（P0.05），且二者表达正相关（r=0.211，P0.05）。结论 免疫组化ADH-5或组合（CK5/6、P63、CD10、HHF-35）对乳腺癌与导管内增生性病变鉴别诊断有帮助；Survivin和VEGF高表达是乳腺癌发生、侵袭转移及预后的潜

4、在评估指标。【关键词】 乳腺，癌；导管内增生；生存素；血管内皮生长因子；免疫组织化学；诊断，鉴别；预后中图分类号：Immunohistochemical research in differential diagnosis and prognosis evaluation of breast cancer and intraductal proliferative lesionsWANG Gang-ping,LIANG Yun-ai,ZHANG Zuo-feng,et al.（Department of Pathology,Affiliated Rizhao Peoples Hospital

5、of Jining Medical College,Rizhao 276826,China）Abstract: Objective To investigate the immunophenotypic features of markers of breast carcinoma and intraductal proliferative lesions.Methods Immunhistochemical UltraSensitiveTM S-P method was employed to detect the expression of CK5/6,P63,CD10,HHF-35,ER

6、,Survivin and VEGF in 60 cases of usual duct hyperplasia(UDH),57 cases of atypical ductal hyperplasia(ADH),89 cases of ductal carcinoma in situ(DCIS) and 128 cases invasive ductal carcinomas(IDC).The molecular markers staining modes of CK5/6,P63,CD10 and HHF-35 were observed.The multiple biological

7、parameters including the tumor size,grade,Lymph node status,tumor metastasis and stage were compared with and investigate the associations of Survivin and VEGF expressions in breast carcinoma.Results Myoepitheliums at the periphery of ducts were stained positive for P63（83.3%）,CD10 (75.0%),HHF-35（81

8、.7%）.The hyperplasia areas were scatteredly stained positive for CK5/6 and ER.The positive rates of Survivin and VEGF in IDC ,DCIS and ADH were higher than in UDH tissues,P0.01.There were significant differences in the positive expression rates of VEGF between DCIS and IDC,ADH and IDC,however,there

9、were no significant differences of Survivin expression between IDC and DCIS,IDC and ADH tissue（P0.05）. Positive expression rates of Survivin and VEGF were found no significant between ADH and DCIS tissue.There was positive correlation in over-expressions of Survivin and VEGF with histological grade,

10、lymph node metastasis,distant metastasis and stage of IDC tumor,and the expression of VEGF was correlated positively with Survivin（r=0.211, P0.05）.Conclusions The kinds of immunomarkers of ADH-5 or CK5/6,P63,CD10 and HHF-35 have practical value in identification of breast carcinoma and intraductal p

11、roliferative lesions.The over-expression of Survivin and VEGF might be important biological markers for invasion and metastasis of invasive ductal carcinomas.The combined detaction of Survivin and VEGF are the predictors for prognosis of breat carcinoma.key words: Breast,cancer; Intraductal prolifer

12、ative lesions; Survivin; VEGF; Immunohistochemistry; diagnosis,differential; prognosis目前我国乳腺癌发病速度高出发达国家,在一些城市已成为女性首位恶性肿瘤1。乳腺导管内增生性病变是一组异质性病变，普通导管增生（usual duct hyperplasia，UDH）、非典型导管增生（atypical ductal hyperplasis，ADH）及导管原位癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）发展为浸润癌的风险各不相同2-3。近来免疫表型分子学研究推动了乳腺癌及导管内增生性病变认识的深

13、入和诊断的准确性2-4。早干预对预后有重要意义，临床和病理学迫切需要与诊断和判断预后相关的简便易行的早期检测方法或指标5-6,对导管内增生性病变与乳腺癌关系的免疫组织化学系列研究较少，本组对334例大宗病例进行了研究，探讨免疫组织化学在其鉴别诊断及早期评估预后的作用。1 材料与方法1.1 一般资料收集2004年6月至2013年6月住院有完整临床和随访资料经手术病理证实的334例乳腺癌及导管内增生性病变，包括60例普通型导管增生（usual duct hyperplasia，UDH）、57例非典型导管增生（atypical ductal hyperplasia，ADH）、89例导管原位癌（duc

14、tal carcinoma in situ，DCIS）和128例乳腺浸润性导管癌（invasive ductal carcinoma，IDC），研究免疫组织化学ADH-5、CK5/6、CD10、P63、HHF-35在其诊断和鉴别诊断中的价值，及生存素（Survivin）和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达与肿瘤大小、分级、淋巴结及远处转移、分期等因素的关系，探讨其早期评估潜在预后的价值。上述病例均按现行WHO（2012）诊断标准2由两位主治以上病理医师重新核实诊断。全部病例术前均未接受放、化疗和其他内分泌治疗。IDC患者年龄

15、2277岁，中位51.24岁；46例肿瘤最大径2.0 cm，63例25 cm、19 例5.0cm；组织学级22例，级74例，级32 例；腋窝淋巴结无转移45例，13个淋巴结转移51例，3个转移32例；远处转移37 例。按照国际抗癌联盟TNM的分期标准期23例，期44例，期22例，期39例。1.2 免疫组织化学方法及结果判读鸡尾酒双染乳腺分子标记物ADH-5（Atypical Ductal Hyperplasia），购自Biocare Medical公司，含CK7、CK18、CK5、CK14、p63，应用聚合物MACH 2 Double Stain 2检测，CK5、CK14、p63采用DAB显色

16、呈棕黄色，CK7、CK18采用Fast AP-Red显色呈红色。其余试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司，采用UltraSensitiveTM S-P法，DAB显色。以组织自身阳性作内对照，用PBS代替一抗作阴性对照。P63定位于细胞核，CD10于细胞膜，CK5/6、HHF-35、VEGF定位于细胞质，Survivin在不同组织中细胞质和/或细胞核异质性表达。1.3统计学方法采用SPSS17.0软件包，计数资料样本率组间比较用2检验，相关性检验采用Spearman等级相关分析，P0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 免疫表型辅助鉴别诊断UDH特征性周边二级管腔43例，中央流水样排列3

17、8例；实性增生11例；有微小坏死灶3例，HE切片不能除外DCIS。50例UDH管周肌上皮P63不连续阳性，45例CD10间断阳性，49例HHF-35阳性，管内细胞CK5/6、ER阳性呈明显异质性，CK5/6呈马赛克样表达模式；ADH-5能100%鉴别UDH、ADH和DCIS及微浸润癌。UDH弥漫性或灶性CK5/6阳性41例；管周肌上皮P63、CD10、HHF-3557例阳性，管内细胞CK5/6、CK19、ER阳性呈异质性，CK5/6呈马赛克样表达模式；ADH无CK5/6表达，是ADH与UDH的鉴别标记。高级别DCIS呈微乳头状、筛状或实体状，具有高级细胞核，管周肌上皮P63、CD10、HHF-

18、35阳性，IDC则阴性。微浸润癌在DCIS周围可见单个或簇状细胞间质微浸润。2.2 Survivin 和VEGF的表达Survivin在UDH中主要在细胞质表达，IDC、DCIS和ADH组则在细胞质和细胞核中均有表达，在IDC中在细胞核中表达增多；VEGF定位于细胞浆。不同组织中Survivin 和VEGF的表达率见表1。Survivin和VEGF的表达，与UDH组比较，IDC、DCIS和ADH组差异均有统计学意义（P0.05）；IDC与DCIS（2=1.330，P=0.249；2=12.298，P=0.001）、IDC与ADH（2=1.484，P=0.223；2=16.589，P=0.000

19、）比较，VEGF表达差异有统计学意义（0.05）。DCIS与ADH比较，Survivin和VEGF的表达均无统计学意义（2=0.039，P=0.0843；2=0.938，P=0.333）。表1 Survivin 和VEGF在乳腺癌及导管增生性病变不同组织中的表达组织类型nSurvivinVEGF-+2P值-+2P值乳腺浸润性导管癌1284286（67.2%）70.5400.000*4088（68.8%）38.9930.000*导管内增生性病变导管原位癌893653（59.6%）51.9670.000*4940（44.9%）9.8150.002*非典型导管增生572433（57.9%）42.82

20、90.000*3621（36.8%）4.0950.043*普通型导管增生60591（1.7%）-4812（20.0%）-* 均与普通导管增生比较，P0.052.3 乳腺癌中Survivin 和VEGF的表达与临床病理因素的关系见表2。Survivin和VEGF在乳腺癌中的表达在不同组织学分级、有无淋巴结及远处转移组间比较，差异有统计学意义（0.05）。表2 Survivin和VEGF的表达与乳腺癌临床病理因素的关系临床病理因素nSurvivinVEGF+阳性率（%）2P值+阳性率（%）2P值年龄（岁）5068464667.6%肿瘤大小（cm）51097064.2%2.9330.0877367.

21、0%1.0800.2995191684.2%1578.9%组织学分级I+ II965759.4%10.6310.0015860.4%12.4120.001III322990.6%3093.8%淋巴转移有836375.9%8.1350.0046477.1%7.6770.006无452351.1%2453.3%远处转移有373594.6%17.7320.0003286.5%7.6210.006无915156.0%5661.5%分期I+ II673856.7%6.9920.0083450.7%21.2110.000III+614878.7%5488.5%2.3 乳腺癌中Survivin 和VEGF表

22、达的相关性 见表3。结果显示Survivin 和VEGF在乳腺癌中的表达呈正相关（r=0.3130.211，P=0.017）。表3 乳腺浸润性导管癌中Survivin 和VEGF表达的相关性VEGFnSurvivinr2P值-+-4019215.6930.2110.017+8823653 讨 论乳腺导管内增生性病变发展为浸润癌的风险各不相同，UDH是正常人的1.5倍，ADH为3-5倍，DCIS为8-10倍；一些病变是危险因素，而另一些则是真正的癌前驱病变2；DCIS异质性明显，其病理组织形态、分子生物学改变及进展为浸润癌的危险各不同2。乳腺癌及癌前病变早期症状隐匿，虽然钼靶X线影像学在筛查中起

23、重要作用，但定性难，具有一定的漏诊率和误诊率。近来免疫表型和分子遗传学推动了乳腺ADH、DCIS等肿瘤性增生研究的深入和准确诊断，对于鉴别部分组织学形态结构非常相似的低级别DCIS和ADH，以及鉴别微浸润灶小于1毫米的微浸润癌与原位癌，免疫组织化学可起到一定辅助作用2。本组结果显示正确地选择和使用标记物，注重表达模式，密切结合HE图像可以鉴别乳腺UDH与ADH、DCIS，肌上皮染色可以区别假浸润与浸润性癌3。CK5/6的表达模式以及肌上皮存在与否是UDH、DCIS、IDC的主要鉴别指标，在组织学基础上辅助肌上皮染色，ADH-5肌上皮棕黄色或HHF-35、P63、CD10阳性，HHF-35、P6

24、3、CD10染色肌上皮跳跃性棕黄色，且周围肌纤维母细胞、纤维母细胞着色，本组部分病例采用ADH-5鸡尾酒染色，肌上皮连续性显示为棕黄色，直观重复性好，且节省染色剂和诊断时间。本组结果显示，免疫组化ADH-5或组合（CK5/6、P63、CD10、HHF-35）可有效鉴别UDH、ADH、DCIS及微小浸润性癌。UDH是由CK5/6阳性的干细胞及其腺型后代组成的良性上皮增生，呈马赛克状染色表达模式2，管周肌上皮P63、HHF-35阳性。新近鸡尾酒乳腺非典型增生抗体ADH-5可以大大提高诊断准确率和缩短鉴别诊断的时间。本组结果显示，CK5/6在UDH及ADH中近基膜侧和近腔缘侧可见阳性细胞，其中以UD

25、H组阳性细胞数较多，呈弥漫性、拼花状排列；ADH组中阳性细胞数少且散在；在ADH及DCIS组近基膜侧可见阳性细胞，近腔缘侧阴性。HHF-35在UDH组、ADH组中肌上皮胞质均呈连续性、线性分布，在DCIS组中肌上皮胞质呈间断性分布。P63定位于乳腺肌上皮细胞核，特异性高，腺上皮阴性，间质肌纤维母细胞和血管平滑肌细胞阴性，但不能显示连续的肌上皮。本组用ADH-5抗体标记，其中CK7、CK8/18在UDH中呈簇状表达模式，ADH和DCIS主要为弥漫表达模式。UDH灶内含有对不同分子量细胞角蛋白反应的多种细胞，包括定向干细胞、腺中间细胞和腺终端细胞镶嵌式阳性着色，这是ADH-5抗体染色UDH的特征性

26、免疫构型，UDH边缘总会出现棕黄色肌上皮细胞。ADH组、DCIS组CK5/6阳性表达率均明显低于UDH组，特征性肿瘤性增值细胞CK5/6一般阴性，或少部分阳性，而CK8等阳性。对DCIS肿瘤标记物的临床研究不及浸润癌广泛。与IDC中的阳性率，本组HER2在DCIS中阳性率高达44.9%，远高于IDC，DCIS中HER2阳性组预后相对好，HER2在导管内和导管外肿瘤的作用恰恰相反，HER2阴性的DCIS发展为IDC的概率远较阳性高8。Survivin是凋亡抑制因子，具有抑制凋亡、调节细胞分裂的双重功能，在人原始胚胎、胎儿和胃腺癌等肿瘤组织中高表达，而在分化成熟的组织中不表达或低表达9-10。本组

27、实验表明， IDC、DCIS、ADH中Survivin高表达，明显高于UDH（P0.05），说明Survivin在肿瘤性增生的早期就发生了改变，参与了乳腺癌变。Survivin在IDC高表达，与组织学分级、淋巴结及远处脏器转移、肿瘤分期呈正相关（P0.05），提示Survivin的高表达与乳腺癌的发展、不良生物学行为正相关。本组Survivin在IDC大部分为细胞质表达，少部分呈细胞质和细胞核表达，文献见类似报道9-10，正常乳腺组织中仅有微量的Survivin蛋白表达，而在大部分乳腺癌组织中均能检测到Survivin表达，Survivin在良性病变中主要在细胞质中表达，乳腺癌则在细胞质和细胞

28、核也有表达，Survivin胞核表达情况有望成为评价乳腺肿瘤恶性程度的生物学指标9-10。Jha报道乳腺癌免疫组织化学Survivin约65.3阳性，而RT-PCR高达93.6有Survivin mRNA高表达，Survivin有望成为乳腺癌早期诊断的潜在指标，甚至是转移的早期诊断指标9-10。Survivin高表达抑制正常细胞的凋亡，从而导致细胞的异常增生和恶性转化，Survivin 在肿瘤细胞中表达越强，其对癌细胞凋亡的抑制能力越强，癌细胞的生存能力和肿瘤的恶性程度也随之增高，癌细胞更容易侵袭周围组织而发生转移，表明Survivin 蛋白的高表达是乳腺癌预后不良的标志。肿瘤新生血管生成促进

29、了肿瘤的生长、侵袭和转移增强。VEGF是一种同源二聚体糖蛋白，与PDGF同源，促进细胞有丝分裂，诱导毛细血管芽新生，增加微血管通透性，参与肿瘤细胞的浸润、迁移，促进细胞移行和抑制凋亡。本组VEGF在IDC中的阳性表达高于DCIS、ADH和UDH。IDC与DCIS和ADH比较，差异均有统计学意义，而DCIS和ADH比较，VEGF的表达差异无统计学意义；Survivin 和VEGF的表达与组织学分级、淋巴结及远处转移、肿瘤分期呈正相关，提示VEGF高表达可能与乳腺癌的发生、侵袭转移不良生物学行为有关，高表达可作为判断乳腺癌肿瘤血管形成、侵袭转移及预后的一项指标。恶性肿瘤发生、发展和转移的各阶段，至

30、少有2个或2个以上功能不同异常激活的基因各自作用，促进细胞癌变，共同增强肿瘤侵袭和转移能力。本组资料显示Survivin 和VEGF在乳腺癌的表达正相关，两者间可能是通过协同作用来促进肿瘤的发生、发展，共同参与乳腺癌的发生、发展和淋巴结及远处转移，Survivin和VEGF可作乳腺癌判断生物学行为和预后的指标。参考文献1 Wang G,Qin Y,Zhang J,et a1.Nipple Discharge of CA15-3,CA125,CEA and TSGF as a New Biomarker Panel for Breast CancerJ.Int.J.Mol.Sci,2014,15(6):9546-9565.2 Lakhani SR,Ellis IO,Schnitt SJ,et a1.WHO classification of tumours of the breastM.Lyon,France:IARC Press,2012:1-73.3 HYPERLINK /search?facet-author=%22Gangping+Wang%22 Wang G, HYPERLINK /search?facet-author=%22Hong+Zhang%22 Zh