猪繁殖和呼吸障碍综合征病毐的研究进展

1、猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)的研究进展要 点历史PRRS病原学分类地位及分型基因组结构一般特性病毒蛋白 总结发生情况1987年 ,美国的北卡罗纳、衣阿华等州首次爆发一种以母猪繁殖障碍和仔猪严重呼吸困难为特征的传染病 1 988年发生于加拿大 1 990年 1 1月暴发于西德，很快蔓延到临近国家 1 993年日本也发现本病 1 995我国在北京一带有发生目前全国几乎都有报道病原学分类地位及分型一般特性 基因组结构及功能 病毒蛋白及免疫学特征 PRRSV的分类地位 由于PRRSV为一种有囊膜的单股正链病毒，其基因组结构和转录机制与动脉炎病毒相似，1997年病毒分类委员会将PRRSV归属

2、归于新建立的Nidovirale目、动脉炎病毒科 (Arteriuiridae)、动脉炎病毒属 (Arteriuirus)。同属成员还有动脉炎病毒 (EAV)、小鼠乳酸脱氢酶病毒 (LDV)和猴出血热病毒 (SHFV)。TaxonomyPicornaviridaeFMDVArteriviridaeEAVLDVPRRSVSHFVporcine enterovirusesCoronaviridaecoronavirusesIBVFlaviviridaepestiviruses (BVD)Viruses with +ve RNAgenomesViruses with -ve RNA genomesV

3、iruses with ds RNA genomesViruses with reverse transcriptase分型 亚群A(Wensvoort等 (1 991 )报告的欧洲原型 (LV)株 )亚群B(Benfield等 (1 992 )报告的美国原型 (ATCC VR-2332)株)。(MLV)弱毒株亚型Quebec毒株亚型OPFS亚型 欧洲地区主要流行株为A亚群 ;而美国和亚太地区则以B亚群为主;仇华吉等、杨汉春等、蔡家利等 (1998)用不同的方法检测国内的PRRSV分离株 ,表明我国的PRRSV分离株属于美洲型。进一步的研究表明 :目前美洲型毒株至少有 3个基因亚型 ，其中PR

4、RSV的 (MLV)弱毒株构成一个亚型 ;加拿大Quebec毒株与EAV和LDV间的同源性大于与两个欧洲型PRRSV毒株间的同源性 ;日本毒株和台湾毒株OPFS与美洲毒株相似。 一般特性形态特征抵抗力病毒的血凝性培养特性 PRRSV病毒粒子呈球形,直径约为 6 ,含有 2 5 35的核衣壳 ,呈二十面体对称 ,外绕一脂质双层膜 ,表面有细纤突。 在蔗糖中的浮密度为1.1 4/3 ,在氯化铯梯度中浮密度为 1.1 9/3 。投射电镜图模型形态特征投射电镜图模型GP2GP5MGP42bN抵抗力PRRSV在外界环境的生存力相对较弱。对类脂质溶剂 (如氯仿、乙醚等 )敏感。病毒对温度敏感 , 56加热

5、 45分钟 可使其灭活；但在 -70条件下 ,病毒保存 4个月以上，其感染滴度不变。该病毒在很窄的pH值范围内存活,若7时 ,感染力降低 90 %以上。这一点在分离病毒时要求快而无污染。病毒的血凝性 PRRSV不能凝集猪、山羊、绵羊、牛、兔、豚鼠、人型以及鸡、鸭、鹅的红细胞。 Juna等用株日本分离的PRRSV能能对小鼠红细胞表现出凝聚性 。当用吐温 - 80和乙醚处理后血凝性增强。 肝素影响PRRSV的这种血凝活性 。而肝素不能与小鼠红细胞发生作用 ,表明肝素可能对PRRSV血凝抑制是直接与病毒血凝素作用而产生的 。培养特性PRRSV的分离：最好采用流产死胎或活产仔猪的肺、心、脑、肝、肾和脾

6、等作样品 ;对哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪 ,最好采集肺脏 ,也可以用脾、脑扁桃体、白细胞、气管周围淋巴结和胸腺作样品 ;对母猪则采用血清、血浆和血细胞作样品;用木乃伊胎儿则难以分离到病毒。体外培养：PRRSV特别嗜好在猪原代肺泡巨噬细胞 (PAM)中生长 ，也可在非洲绿猴肾传代细胞2 62 1 、1 45及1 45的克隆株2等中复制，并产生CPE（细胞变圆、聚集、脱落呈空斑、蹦解）。在进行病毒分离时,由于有些毒株只适应于PAM细胞，故最好同时接种几种细胞。 基因组结构及功能基因组结构 作为动脉炎病毒属的一员，PRRSV的核酸为单股、正链、不分段的RNA，大小为15kb，成线形，5端有帽的结构，

7、3端有非编码区和PolyA尾巴结构，5和3端都有一定程度的保守区，与EAV、LDV、SHFV的相似。PRRSV基因组有 8开放阅读框(ORF)。 5端的ORF1约占基因组的 80 %，长约1 2, 包括ORF 1和ORF 1,编码病毒有关的聚合酶和复制酶。 ORF 2 7位于3端，编码 6种病毒结构蛋白GP2、GP3、GP4、GP5 4种糖基化蛋白及内膜蛋白M和核衣壳蛋白N两种非糖基化蛋白。最近Wu （2001）等发现在ORF2上游ORF2a有一个阅读框，编码一个10kd的结构蛋白。 1a1b46基因组结构及功能以上基因组及其对应蛋白的功能逐渐得到阐明：5端的非编码区的作用是作为5前导序列引导

8、各亚基因组mRNA的翻译，从而介导各结构蛋白的表达。3末端的非编码区的功能是作为病毒复制酶的识别和结合区域，以启动负链RNA的合成。ORF1a编码产物为一个聚合蛋白，可被自身编码的蛋白酶切割成六个非结构蛋白：Nsp1a, Nsp1b, Nsp2, Nsp3, Nsp4, Nsp5。ORF1b的产物为一个聚合蛋白，有3个蛋白酶裂解位点，推测是被ORF1a的编码产物切割，产生四个非结构蛋白:RdRp, CP2, CP3, CP4，RdRp是PRRSV的复制酶，其他的非结构蛋白的具体功能不详 .PRRSV Genome 11a1b2a4653ORFNsp1aORFNsp2Nsp4Nsp3Nsp5Rd

9、RpCp2Cp3Cp4Nsp1b一个聚合蛋白 PRRSV Genome 21a1b2a462b357234567sg mRNAGP22bGP4GP5MNGP353N-glycan(+)-ssRNA genome, 15 kilobasesnested array of subgenomic mRNAs病毒蛋白及免疫学特征 病毒蛋白及其部位核衣壳蛋白 膜基质蛋白 糖蛋白4 糖蛋白5 糖蛋白3 糖蛋白2GP22b病毒粒子GP2GP5MGP42bN核衣壳蛋白 核衣壳蛋白 :由病毒基因ORF7编码 ,为非糖基化蛋白，大小为：15Kda。用抗单抗证明存在保守和变异的抗原位点。用N蛋白单克隆抗体证实了N蛋

10、白是PRRSV主要的免疫显性蛋白，N蛋白上有多个抗原决定簇。其中在位和位氨基酸的中心区域，有一个免疫显性的抗原决定簇；N端的位或位氨基酸对该蛋白抗原的正常构象特别重要，如果一旦缺失，则单抗不能与该抗原决定簇反应。由于核衣壳蛋白N是 PRRS病毒免疫原性最强的结构蛋白,目前常用于 PRRS诊断。 膜基质蛋白膜基质蛋白 :由ORF6编码 ,为非糖基化蛋白，大小为：1819KDa。氨基酸序列分析，它有三个跨膜区域。在研究VR - 2385株的基因序列时发现，蛋白是最保守的结构蛋白 ,与株的蛋白有 78%相同。糖蛋白5 糖蛋白5:,由ORF5编码,为糖基化膜蛋白，大小为：2630Kda，又称E蛋白。该

11、蛋白在囊膜内与蛋白由二硫键结合形成异源二聚复合物。Delputte等（）研究发现PAM细胞表面有一种类肝素（Heparin）样的分子受体，它能与PRRSV的M蛋白GP5蛋白异源二聚复合物或N蛋白结合，使PAM细胞感染上PRRSV。该研究提示了PAM细胞表面Heparin受体、M蛋白GP5蛋白异源二聚复合物和N蛋白对PRRSV黏附宿主细胞的机理有密切的关系，同时也为抗感染PRRSV的药物研制提供了一条途径。用单克隆抗体检测发现，5蛋白表面可能有 6种抗原表位 ,其中包括病毒血清型中和抗原表位。最近，Ostrowski等(2002)用PRRSV的中和单克隆抗体和猪高滴度中和血清抗体，从PRRSV的

12、cDNA噬菌体文库中筛选出在GP5蛋白上的两个B细胞抗原位点，称为非中和位点A和中和位点B，其中位点A的抗体能在猪感染的早期即可检测出来，但该位点在PRRSV分离株中高度可变；而位点B除能被相应的单克隆抗体中和外，还能被单抗ISU25-C1和猪中和血清抗体识别，却不能被非中和抗体识别，该位点在PRRSV分离株中高度保守，但只能在猪感染病毒后期的血清中才检测出来。Oleksiewicz等(2002)进一步发现这个B位点隐藏在膜的内部。这给我们提示，位点A诱导猪的机体较早地产生GP5的非中和抗体，由于抗体依赖性的感染和该位点的高度变异性，这种抗体可能反而有利于病毒进入宿主细胞，这也可能与猪的长时间

13、的病毒血症有关。另外，GP5的B抗原位点对设计PRRSV疫苗将十分有利。猪感染后首先产生的抗体主要是针对蛋白的，但该抗体保护率低，随后才是针对M蛋白和5的。糖蛋白4 糖蛋白4:由ORF4编码，大小为：3135KDa，有 4个糖基化位点 ,为 -糖基化蛋白，是病毒的主要结构蛋白之一。4第 40 79位氨基酸为病毒中和抗原决定簇 ,4的单抗具有中和作用 ,推测该蛋白可能暴露在病毒粒子的表面。利用GP4和GP5的单克隆抗体能体外中和病毒，而且GP5的单克隆抗体比GP4的更有效，说明了这些蛋白对感染宿主细胞的机理有一定的作用。糖蛋白3 糖蛋白3 :由ORF3 编码 ,分子量为 4550 KDa ,有7

14、个糖基化位点 ,含 2 65个氨基酸 ,是病毒的结构蛋白。该蛋白的羧基端有一个非中和抗原表位，但该表位与PRRSV血清型有关。用该蛋白制备的特异性单抗 ,仅与一部分PRRSV分离株反应 ,表明这个表达的蛋白质在抗原性上是多形态的。 糖蛋白2糖蛋白2 :由ORF2 编码，肽链内含有二硫键的结构蛋白。Meulenberg等通过免疫印迹和免疫沉淀试验 ,证明LV株的2 为 -糖基化蛋白质 , 但功能尚不很清楚。目前，发现GP2蛋白表面有一个抗原点，其周围有一个VSRRIYQ基元，它们可形成二级结构。进一步发现美洲型毒株毒力相关的基因突变就位于该区域，但还需进一步证实该位点是否为GP2蛋白毒力功能区

15、目前，虽然人们对以上PRRSV蛋白的基础研究还不能完全揭示有关病毒蛋白粘附、毒力、致病性和抗原性的功能，但为预防和控制PRRS提供了宝贵的信息。病毒的生物学和遗传学变异 从临床经验和实验室的许多证据以及分子生物学理论都表明，PRRSV的生物学和遗传学存在很高的变异现象。生物学的差异 临床表现不同：欧洲最早爆发PRRS时，虽然也同北美一样有呼吸和繁殖障碍的临床表现，但人们更易注意到的是当地的PRRS患病猪有耳、乳头、鼻、颈腹侧等处呈蓝色，而北美没有19。人们还发现同一个猪场患PRRS的不同个体猪，临床症状和病变的差异很大。 毒力差异大：Halbur等用剖腹产技术获得五周龄胚胎以及未吃初乳的仔猪，

16、研究比较肺脏的大体及显微镜下的病变，可把9株北美洲PRRSV分为高毒力株和低毒力株。另外，还发现有些毒株有可能引起鼻炎、脑炎和心肌炎；有些美国分离株与LV相比，毒力或强或弱。Mengeling等通过比较不同肺致病性毒力的PRRSV分离株对初产的怀孕母猪感染情况发现，对呼吸道的致病力大小与对生殖道的致病力大小没有必然的联系21。抗原性差异：在九十年代初，人们用主要多克隆猪抗体和小鼠单克隆抗体进行血清学试验，证实了欧美分离株的抗原性有差异，很少有交叉反应。Nelson等根据核衣壳单克隆抗体与病毒的反应性，建议把所有的欧美分离株分为两个抗原亚群，这两个亚群核衣壳蛋白中的保守抗原决定簇的单克隆抗体SD

17、OW12和17被广泛的应用于诊断试剂盒22。遗传学差异 有关PRRSV分离株基因序列分析的研究报道很多，总的来讲，美洲亚群与欧洲亚群之间存在很大的差异。在结构蛋白中，GP5蛋白的氨基酸序列差异最大同源性只有51%-58%。最为保守的是M蛋白，氨基酸序列的同源性为80%左右23。而在非结构蛋白中，NSP2的氨基酸序列的差异最大，美洲株比欧洲株的NSP2的氨基酸序列长102个氨基酸，同源性仅32%。刘光清等（2002）报道中国的分离株CH-1a的非结构基因序列，并与VR-2332和LV进行比较分析，CH-1a的NSP2的氨基酸序列的变异最大，比LV的长118个氨基酸，同源性仅为41%，而与VR-2

18、332的同源性为81%18。 欧洲亚群毒株之间的基因差异很小，而美洲亚群间的差异较大。Suarez等分析了 2 1株欧洲毒株的完整ORF5基因 (553)和部分ORF7基因(256)。结果发现 ,不同国家不同年代的欧洲株ORF7基因高度保守 ,其核苷酸及氨基酸的同源性分别为 94.1 %99.6%和 95. 3% 1 0 0 %。而ORF5呈现高度的变异 ,其核苷酸及氨基酸序列同源性分别为 87 .1 % 99. 2 %和 83 88%24。Andryev 等根据ORF5基因序列，将美洲亚群毒株至少分为6个基因亚型25。Dee等（2001）进一步研究表明，在一个有PRRSV 慢性感染的1750头母猪的种猪场，经过对不同时期仔猪血清内的PRRSV分离和基因检测，该猪场同时存在A、B、C3个基因亚型，它们ORF5基因序列同源性为89%-94.2%，而且同一基因亚型内各毒株的基因同源性为98%-99%，这提示PRRSV毒株之间存在频率较高的基因重组现象26。Van Vugt 通过实验发现，同一亚型之间的重组概率最高，不同亚型之间较低，而欧洲亚群与美洲亚群之间的重组概率比同一亚型的重组概率低一万倍。据报道，同一PRRSV毒株会在不长的一段时间里产生变异。如，弱毒疫苗毒株在选择性压力的作用下，会发生返祖现象，变为强毒株。Madsen等报道，从用R