枣疯病植原体的分子检测与同源性鉴定

1、枣疯病植原体的分子检测与同源性鉴定论文摘要：本文根据植原体16S rDNA通用引物R16mF1/R16mR1，对陕西和山西具有枣疯病的植株的总DNA进行PCR扩增，分别得到1433bp和1432bp的条带，其二者同源性到达99%以上。通过此16S rDNA序列进行Blast检索，挑选27条关于16S rDNA具有明确分组的植原体序列，分析同源性并绘制其系统进化树，结果说明它们和16S rDNA V-B组的遗传距离最近。通过pDRAW32软件，用17种具有16S rDNA分组的典型的限制性内切酶模拟RFLP，结果说明它们和已报道的JWB的RFLP图谱相似。进一步验证枣疯病植原体属于16S rDN

2、A V-B ，说明其地域变异性不大，有利于枣疯病检测技术的建立。论文关键词：枣疯病,植原体,分子检测,同源性前沿枣树原产我国，具有较高的营养价值。近年来，随着生活水平的提高，枣产品的需求量不断增加，枣树的栽培面积迅速扩大。-近年来也大力开展枣树产业，使得枣产业在-果业中占有一定份量。但是随着种植面积的增大，枣树病害也成为制约枣产业开展的一个重要因素。枣疯病堪称枣树的艾滋病;，是一种消灭性病害。目前没有比拟实效的根治方法，所以通过PCR技术检测枣疯病就显得更为重要。枣疯病病原是类似于菌原体的一种极小的微生物，1994年第十届国际菌原体组织大会上改称为植原体。植原体属于柔膜菌纲、植原体属，是一类无

3、巩固细胞壁、存在于植物韧皮部筛管细胞内的原核生物。本文通过获得枣疯病植原体的16SrDNA序列，对枣树的植原体进行同源性分析，构建其系统进化树，为建立更为有效的枣疯病检测体系奠定理论根底。1材料与方法1.1实验材料分别在2021年7月在陕西和山西采取具有枣疯病病症的植株，在石河子大学试验站采取健康植株，保存在-70冰箱里。1.2实验方法称取0.1-0.2g叶片，在液氮中迅速研磨至粉末，将粉末迅速转入预冷的1.5mL离心管中，参加1mlSTE(700mmol/LNaCl，100mmol/L，100mmol/LTris-Cl和50mmol/LEDTA)，再参加5L-巯基乙醇(BME)，迅速混匀，在

4、4下7000r/min离心6min，弃上清液，加人700mL预热的CTAB提取缓冲液(100mmol/LpH8.0Tris-Cl，50mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，2%PVP，3%CTAB，2%BME)和12.5L的BME，迅速摇匀，在65水浴30min每8-10min上下颠倒一次，水浴结束后，参加等体积氯仿-异戊醇(24:l)后轻轻混匀，4离心10min。取上清液至1.5ml离心管中，同上再抽提一次。参加1/5体积的5mol/LNaCl混匀，再加2/3体积冰冷的异丙醇，-20静置20min以上。最后12000r/min离心5min，用75%的乙醇清洗2-3次，在室温下枯燥1

5、0min，使其尽可能枯燥。最后参加含有RNase的TE溶解，并置于37水浴30min。电泳检测，保存在-20即可。根据Lee报道的关于16SrDNA的引物对：R16mF25-CATGCAAGTCGAACGGA-3，R16mR1(5-CTTAACCCCAATCATCGAC-3)进行PCR扩增，以健康样品的总DNA和水为阴性对照，以带病样品的总DNA为阳性对照。反响体系为20L，含有2L10 xPCRBuffer、1L20mol-L引物R16mF2、1L20mol-L、引物R16mR1、0.8L0.25UdNTP、0.2L1.25UTaqDNA聚合酶上海生工公司，2L枣树总DNA，13LddHO。

6、PCR反响程序：94预变性4min，9445s，5645s，721min35个循环，72延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测EB染色，紫外透射仪下观察，并拍照记录实验结果。用百泰克的凝胶回收试剂盒回收目的片段，对其连接转化涂板。用碱式裂解法，提出含有目的片段的质粒DNA,并且对其用R16mF2/R16mR1引物对进行PCR扩增，验证目的片段是否已经连接上。最后送往上海生工进行测序。将所得的目的片段，进行Blast检索分析，并把测序结果登录在GenBank中，通过挑选较为典型的序列，ClustalX1.81对其多条序列进行分析，通过MEGA32软件构建系统进化树。挑选Alu、Mse

7、和Tsp509等17种限制性内切酶，利用软件pDRAW32模拟RFLP，分析确定其种属关系。2实验结果2.1DNA的提取通过CTAB法，提取的DNA如图1，由于植原体在枣树中分部不均匀，应该根据不同时期采取不同组织，本实验采取样品为叶子和枝条。通过对总DNA的粗提取物和总DNA提纯后的物质进行比对，由于枣树含糖量比拟高，所以提纯后DNA的电泳效果较好，但是进行PCR比拟，未测发现二者差异性，是否提纯DNA对实验的影响不大。此方法可以应用于枣树总DNA的提取中。2.2PCR检测 通过对带病的两个不同品种进行PCR检测，均可以扩增出1400bp左右的大小条带，而健康植株中和水中均不能扩增出此特异性

8、片段，说明患有枣疯病的枣树中含有植原体图2。图1枣树总DNA提取电泳图谱图2枣疯病植株总DNA的PCR产物电泳图谱Ck：健康植株SX：陕西病株SH：山西病株CK1：水CK2：健康植株SX：陕西病株SH：山西病株Fig1ElectrophoresispatternofFig2ElectrophoresispatternofPCRproductsoftotalDNAfromJujubetotalDNAfromJWBCK：healthyJujubeSX：JWBfromShaanxiCK1：DoubledistilledwaterCK：healthyJujubeSH：JWBfromShanxiSX：J

9、WBfromShaanxiSH：JWBFROMShanxi2.3测序检测及同源性分析通过上海生工进行测序，在陕西和山西的材料中分别获得1433bpJWB-NTSH和1432bpJWB-NTSX两条不同的片段，GC含量较高，在GenBank中的登录号分别为GU594058、GU574807。应用DNAman软件分析JWB-NTSH和JWB-NTSX，同源性到达99.37%，通过Blast比照，与报道的植原体相关片段的同源性到达88%以上 L33763 98.39% 16Sr-B 枣疯病Jujube witches-broom (JWB ) AY197661 99.65% 枣疯病山西株JWB-NT

10、SH GU594058 99.37% 16Sr-C 悬钩子丛枝病Rubus stunt (RuS) Y16395 90.00% 16Sr 三叶草簇叶Clover proliferation (CP) L33761 92.74% 16Sr 白蜡树黄化Ash yellows(AshY) X68339 95.61% 16Sr 丝瓜丛枝Loofah itchesbroom(LfWB) L33764 94.77% 16Sr 木豆丛枝Pigeon pea witchesboom(PPWB) AF248957 92.26% 16Sr 苹果丛簇Apple proliferation(AP) AF248958

11、90.01% 16SrI 水稻黄矮Rice yellows dwarf D12581 93.23% 16SrII 澳大利亚葡萄黄化Australian grapevine yellows(AGY) X76427 87.87% 16SrIII 墨西哥大草白叶Mexican periwinkle virescence AF248960 88.45% 16SrIV 百慕大草白叶Bermuda grass white leaf (BWL) EF444486 93.23% 16SrV 扶桑丛枝Hibiscus witches -broom AF147708 88.66% 2.4构建系统进化树将JWB-N

12、TSH和JWB-NTSX同已报道的16SrRNA进行比照，构建进化树，通过软件ClustalX1.81和软件的MEGA4构建进化树从GenBank中挑选植原体16SrDNA的15个种，27条具有确定种属关系的代表性序列见表1，把这些序列通过ClustalX1.81进行分析，并应用MEGA4软件构建系统进化树。如图3所示，其中JWB-NTSX被划分到16SrDNAV-B中，和的枣疯病植原体属于同一个亚种，JWB-NTSH和JWB-NTSX还是有一定的差异性，说明枣疯病植原体随地域的变化可能发生变异，但是变异的碱基比拟集中，和Blast中搜索的植原体变异的区域类似，说明同枣疯病植原体序列比拟保守，

13、这使得枣疯病的分类比拟容易，更有利于枣疯病分类及其检测的研究。 图3枣疯病植原体及相关植原体16SrRNA基因核苷酸序列的系统发育树Fig.3PhylogenetictreeofJWBandotherrelatedphytoplasmasbasedonthe16SrRNAgenesequences2.4RFLP模拟 通过软件pDRAW32软件对JWB-NTSH，JWB-NTSX及JWB以及PPWB进行模拟RFLP试验，其中选取已报道的区别16SrDNA种属的17种典型的限制性内切酶。实验结果说明JWB-NTSX和JWB-NTSH及JWB酶切图根本相同，其中JWB-NTSH和JWB在HaeIII

14、和MseI两处不同，JWB-NTSX和JWB在RsaI一处不同。说明JWB-NTSX和JWB的关系比JWB-NTSH和JWB的关系近。而JWB-NTSH和JWB-NTSX均和PPWB的酶切图在AluI、BstUI、DraI、HinfI等处不同，此结果进一步验证系统进化树的分析结果的正确性。说明利用Lee设计的通用引物对枣疯病总DNA进行PCR扩增，克隆测序，获得16SrDNA的局部序列。通过研究16SrDNA的序列，发现其序列的同源性到达99.37%，与报道的植原体相关片段的同源性到达88%以上。通过查阅植原体16SrDNA相关文献，挑选出植原体16SrDNA的15个种，27条种属明确的代表性

15、序列。通过构建系统分类树，发现JWB-NTSH和JWB-NTSX均属于16SrDNAV-B中，与已经报道的植原体分类相符合。同时挑选出关于植原体16SrDNA分类的典型的17种限制性内切酶，模拟RFLP对其分类做进一步验证，JWB-NTSX和JWB-NTSH及JWB酶切图根本相同，而JWB-NTSH和JWB-NTSX均和PPWB的酶切图在AluI、BstUI、DraI、HinfI等处不同,说明JWB-NTSX和JWB-NTSH及JWB亲缘关系比拟近，和PPWB的亲缘性较远，此结果和构建的系统分类树分析结果是一致的，所以枣疯病植原体应该被分到16SrDNAV-B组中，为枣疯病植原体的分类提供可靠

16、的分子水平的理论依据。4结论近年来，-枣树产业不断的开展，枣疯病的研究就显得极其重要。目前我们在-南疆发现具有枣疯病病症的植株，本文通过对枣疯病植原体16SrDNA进行PCR扩增检测，并且通过构建其系统分类树和模拟RFLP实验，确定出枣疯病植原体的变异随地区差异性较小，并进一步确定其属于16SrDNAV-B组，为建立更为灵敏准确的枣疯病检测体系建立理论根底。参考文献1 CHEN Zi-wen,CHEN Yong-xuan,CHEN Zen-an.Recent advance in the study of Jujube witches broom.Journal of Nanjing Agri

17、cultural University,1991,14(4):49-55.2 ZHOU Jun-yi,LIUMeng-jun,HOU Bao-lin.Advances in research on witch-broom disease of Chinese Jujube .Journal of Fruit Science,1998,15(4):354-359.3 LAI Fan,LI Yong,XV Qi-cong,TIAN Guo-zhong.The present status on classification of Phytoplasmas .Microbiology,2021,35

18、(2):291-295.4 TIAN Guo-zhong,ZHANG Xi-jin.Recent advances in Paulownia witches broom disease research . World Forestry Research,1996,2:37-38.5 MA Bing-gang,NIU Jian-xin,MA Lian-yin,TIAN Xin-li,ZHAO Zong-sheng.Extraction of Korla pear DNA and its RAPD analysis .Xinjiang Agricultural Sciences,2001,(01

19、):18-22.6 Lee I M,Davis R E,Chen T A,Chiykowski L N,Fletcher J,Hiruki C,Schaff D A. A genotype based system for identification and classification of mycoplasma like organisms(MLOs) in the Aster yellows MLO strain cluster.Phytopathology,1992,82(9):977-986.7 LI Yong. Current status and problems of molecular classification in the Phyt