基因操作原重难点总结

1、基因操作原理重难点总结基因克隆的宏观策略：答:已知序列同源性的基因的克隆(PCR方法克隆目标基因)：根据已知基因序列信息设计引物，以基因组DNA为模板，扩增出目标基因；定位在质粒上的基因克隆：利用识别六碱基的限制性内切酶酶解质粒DNA,电泳分离，然后用特异探针进行杂交，确定基因片段进行克隆；定位在染色体组上的基因克隆：杂交方法：i.用识别四个碱基的限制性内切酶对染色体DNA进行部分酶切，建立基因文库。再用标记特异探针进行探测，确定目标基因片断，再进行克隆。ii.利用亚基因文库进行克隆先进行分子杂交，确定基因片断范围，再进行克隆筛选。免疫抗体法：利用鸟枪法和表达载体建立基因表达文库；利用目标蛋白

2、质制备抗体，对基因表达文库进行筛选，可直接获得完整的基因。利用简并引物的PCR方法：对目标基因的蛋白质进行N-端氨基酸残基分析。根据氨基酸序列反推目标基因设计简并引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目标基因。转座子插入失活克隆法：用转座子对目标生物进行突变，筛选突变株，抽提突变株基因组DNA，利用转座子序列信息设计特异探针，进行TAIL-PCR双向扩增，从而获得完整基因。质粒拯救法：利用带有复制起始位点的转座子进行诱变获得突变株，分离总DNA，酶解、连接、转化和测序。功能克隆法(基因表达产物应有明显的表型效应)：利用目标基因表达产物的表型效应，从基因文库中筛选目标基因。通过双杂交系统

3、克隆新基因：通过靶标蛋白利用双杂交系统克隆与该靶标蛋白作用的蛋白质基因。通过蛋白质组学技术克隆基因：通过肽片断序列获得蛋白质信息，从而在基因组中找到基因位置和序列，根据序列设计引物，扩增克隆该基因。设计从某一生物中克隆某一基因的技术路线：答：原核生物：从样品中抽提总DNA，部分酶切，构建合适载彳一将目标DNA片段与载体连转入宿主细胞培养一一可以根据该目标基因所表现出的特定表型筛选，或是利用核酸探针杂交法、抗体免疫法和差异杂交法筛选。真核生物：提取样品总RNA并分离mRNA用反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA合成第二链cDNA双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖利用各种筛选

4、方法来筛选目的基因，如表型筛选法、杂交筛选、PCR筛选和免疫筛选。描述原核生物基因表达的基本元件：答：(1)启动子：DNA序列中被RNA聚合酶、转录调节因子等识别并结合形成转录起始复合物的区域。Sextamabox:也称-35序列，识别序列。其中心位于起始点上游大约35bp处。其共有序列为TTGACA.是RNA聚合酶的识别位点(Rsite)；Pribnowbox:也称-10序列，在起始点的上游，其共有序列为TATAAT，是RNA聚合酶的紧密结合位点(Bsite)，在Pribnow框内DNA的双螺旋解链17个核苷酸左右，与RNA聚合酶形成所谓开放性启动子复合物，从而使RNA聚合酶定向，行使其转录

5、功能；转录起点为+1位点(Isite)；这三个位点定义为核心启动子。核心启动子上游的-70-40区域含有与CAP-cAMP复合物结合，激活转录的正控制位点，即上游控制因子(USE)。核心启动子与上游控制因子一起被统称为扩展的启动子。终止子：一个或多个发夹结构，连续的6个U是RNA聚合酶从模板上解离下来的信号。根据体外试验中转1/11 /11录终止是否需要特定辅助因子Rho(p)的参与，又分为两种：不依赖p因子的终止子和依赖p因子的终止子。SD序列：位于mRNA5端，被核糖体识别并结合的较为保守的核苷酸序列，在原核生物中该位点称为SD序列，位于起始密码上游310bp的位置，同16SrRNA3端的

6、序列互补。起始密码子：AUG；终止密码子：UAG,UAA,UGA；(6)调节基因：位于启动子的上游，编码调节蛋白，阻遏蛋白与操纵基因结合阻止基因表达，诱导蛋白结合在启动子区域，加强基因的表达。(8)操纵基因：与阻遏蛋白结合，终止转录。试述限制性内切酶的作用特点：命名和写法也需要掌握。答：根据酶的组成、识别和切割的位点及是否需要辅助因子可将限制性内切酶分为三类：II类限制性内切酶占内切酶的绝大部分，由修饰酶和切割酶组成，识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA双链，产生3，-OH和5，-P基团的DNA产物，反应需Mg2+不需ATP。不同限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果有3种情况：

7、产生3,突出粘性末端。产生5,突出粘性末端，产生平末端，另外，有些限制性内切酶还具有星星活性，即在极端的条件下，如高PH值和低离子强度下，限制性内切酶可以切割类似但不同于其特定识别序列的序列。最常见的一类活性改变是允许碱基替代和识别序列中碱基的缺失。试述利用DpnI进行定点诱变的原理和方法：答：限制性内切酶DpnI用于定点诱变是因为它可特异性地切割双链中的匸ATC位点，对半甲基化的DNA切割效率低，完全不能切割非甲基化DNA。PCR扩增时，诱变引物与预发生突变的模板之间具有单个碱基的错配，扩增结果使错配进入到模板序列中。由于用4种dNTP在体外扩增的产物不含有DpnI识别的甲基化位点，而模板质

8、粒DNA在宿主体内的内源性Dam甲基化酶催化下已完全甲基化，所以DpnI就会切割消化模板DNA，而新扩增的DNA则被保留。再以扩增的DNA为模板合成其互补链，则互补链就为实现定点诱变的DNA。方法：加热变性质粒DNA，然后退火使含有突变位点的引物与质粒DNA配对；热循环扩增掺入突变的引物，产生有缺口的环状链；用DpnI降解模板链；将退火形成的有缺口的双链DNA分子转化到大肠杆菌XL1-Blue中；XL1-BlueE.coli细胞修复缺口，成为定点突变的质粒DNA。定点诱变有哪些方法，其原理又是什么？答:寡核昔酸介导的定点诱变：首先，合成能与野生型DNA模板的靶区域退火、并携带所需突变的寡核苷酸

9、，作为体外合成DNA的引物；其次，由DNA聚合酶根据模板序列延伸寡核苷酸，产生含有预定突变的双链DNA。模板既可以是DNA片段，诱变合成后克隆到合适的载体上；也可以是完整的质粒(v9kb)。模板既可以是单链的，也可以是双链的。最后，对突变体DNA进行测序，验证靶点的突变，并确保其他区域没有发生额外的突变。Kunkel定点突变：该方法通过产生带尿嘧啶的DNA作模板，可高效率地筛选突变克隆。在制备单链模板时采用undu突变的大肠杆菌菌株，该菌株合成的DNA中部分胸腺嘧啶被尿嘧啶取代，在体外用含突变位点的诱导引物引导合成杂合的互补双链DNA，然后再转入正常undu菌株，带尿嘧啶的野生型DNA链被尿嘧

10、啶-N-糖基化酶水解产生脱碱基位点，不再具备作为复制模板的能力，只有带有突变位点的新合成链可以作为模板进一步复制，这样只有带突变位点的细胞才能生长。位点选择诱变：该法使用了2个寡核苷酸引物，一个是用来引入突变的突变引物，另一个是用来选择用的。选择性引物可用来恢复有缺陷的抗生素抗性基因，同时也用来选择引入突变的DNA链。该方法需要特定载体一含有一个有缺陷的抗生素抗性基因。转化子诱变：该方法也使用了2个寡核苷酸引物，除了突变引物外，还使用了一个用来剔除单一酶切位点的引物，故亦称酶切位点剔除法。将待突变的DNA片段装载到克隆载体上，该载体上必须存在一个单一酶切位点。当这两个引物同时指导DNA合成时，

11、突变的DNA链将不再含有该单一酶切位点，而模板DNA在该位置能被切割。通过转化大肠杆菌，线性化的模板DNA不能复制，只有突变链保持环状，可以获得转化子。盒式诱变：是利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，连接到经酶切除去待突变DNA片段的载体上，得到取代突变。待突变区域两侧要含有单一酶切位点，若没有，可先通过定点突变方法引入合适的酶切位点。PCR介导的定点诱变：大引物PCR诱变：该方案需要1个内部致突变引物和1对侧翼引物，需经过2次PCR反应。侧翼引物分别于待突变基因两侧匹配，内部致突变引物与靶位点匹配。设计引物的解链温度以及PCR反应条件，使两次PCR反应能在同一只试管中进行。第一次P

12、CR反应中内部致突变引物和侧引物具有低L.值，使用低退火温度；第二次PCR反应直接在第一次PCR反应之后加入另一个具有高：值的侧引物，使用高退火温度。最终将突变基因片段克隆到载体上。重叠延伸PCR诱变：该法需要1对内部致突变引物和1对侧翼引物，需要经过3次PCR反应。2个内部致突变引物与模板DNA的不同链匹配，都含有预设突变。2个独立的PCR反应分别扩增出2个重叠的DNA片段，突变位点位于重叠区域；混合2个PCR反应产物、或分别纯化后再混合，变性、退火后进行第三个PCR反应，得到突变基因片段，再克隆到载体上。双向PCR快速定点突变：只需要1对引物，经过1次PCR反应。要求2条引物间不重叠，但引

13、物的5端所对应的序列在模板中是连续的。错配碱基在引物的5端，引物3端至少有15个碱基与模板完全匹配，并且要求至少1个引物的5端磷酸化，以使PCR产物末端能连接。基因操作中常用工具酶是哪些？各有什么用处？答：基因操作中最常用的修饰酶有：内切酶和外切酶：识别特定的DNA序列，切割单链或双链，产生黏性末端或平末端，与伴生的甲基化酶一起形成I、II、III三种限制修饰系统。其中基因操作中最常用的是II型系统，它们识别回文对称序列，在序列内部或附近切割DNA，产生带3-羟基和5-磷酸基团的DNA产物，需的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM。甲基化酶(每一种限制性内切酶都对应一种甲基化酶)：甲基化酶

14、可在其识别位点内引入甲基，用于保护DNA不被相应的限制酶所切割。通过甲基化修饰还可产生新的酶切位点。Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌吟N6位置上引入甲基。Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。连接酶：T4DNA连接酶可以催化DNA5，-磷酸和3-0H之间形成磷酸二酯键，用于DNA的粘性末端和平末端连接；E.coliDNA连接酶作用需NAD+的参与，常用于DNA的粘性末端连接和cDNA克隆；T4RNA连接酶可以催化ssDNA或RNA的5-磷酸与另一ssDNA或RNA的3-0H之间形成共价连接，可用于标记DNA和RNA的3末端，单链DNA或RNA的连

15、接；TaqDNA连接酶：可在两个寡核苷酸之间进行连接反应，同时必须与另一DNA链形成杂交体，相当于连接双链DNA中的缺口，需NA。可用与检测等位基因的变化及在PCR扩增中引入寡核苷酸，但不能替代T4DNA连接酶。DNA聚合酶(依赖于DNA的DNA聚合酶)：大肠杆菌DNA聚合酶I具有三种活性：5J3DNA聚合酶活性;5J3外切核酸酶活性；3J5外切核酸酶活性。利用其5J3外切核酸酶活性可用切口平移法标记DNA；用于克隆cDNA中的第二链;对3-突出末端的DNA作末端标记。用蛋白酶将大肠杆菌DNA聚合酶I裂解形成的KlenowDNA聚合酶具有聚合活性和35外切核酸酶活性，可补平有3凹端的DNA或抹

16、平3凸端，还可对DNA进行末/11端标记，在cDNA克隆中合成第二链。T4噬菌体DNA聚合酶与KlenowDNA聚合酶相似，只是外切核酸酶活性更强，在诱变反应中很有用。T7噬菌体DNA聚合酶与T4DNA聚合酶活性类似，是所有DNA聚合酶中持续合成能力最强的一种，可用于长模板的引物延伸。耐热DNA聚合酶：如TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶等，来自嗜高温细菌，主要用于PCR反应。T4多核苷酸激酶（PNK）：一种磷酸化酶，可将ATP的Y-磷酸基团转移至DNA或RNA的5末端。该酶主要用于对缺乏5-磷酸的DNA或合成接头进行磷酸化（消耗ATP），同时可对末端进行标记（先去磷

17、酸化ADPATP,再磷酸化ATPADP）。碱性磷酸酶（如小牛肠碱性磷酸酶，CIP）：该酶催化去除DNA或RNA的5，-磷酸，防止DNA片段的自身连接。用该酶后要进行纯化，避免残留。末端脱氧核苷酸转移酶：源于小牛胸腺的一种不寻常DNA聚合酶，可不依赖于模板。在2价阳离子存在下，该酶催化dNTP加于DNA分子的3羟基端。若dNTP为T或C,阳离子首选C；若dNTP为A或G,阳离子首选。该酶可在cDNA或载体3末端加同聚尾，便于克隆；也可用标记的rNTP、ddNTP或ddNTP来标记DNA片段的3末端。反转录酶即依赖于RNA的DNA聚合酶：有5，十3合成DNA活性，但是无3f5外切核酸酶活性，该酶主

18、要用来cDNA克隆中第一链的合成、测定mRNA转录起始点、5突出DNA的补平和标记、双脱氧终止法测序、RT-PCR等。该酶有两种来源：AMV（禽成髓细胞瘤病毒）反转录酶：具53合成DNA活性和RNaseH活性；Mo-MLV（鼠白血病病毒）反转录酶。依赖于DNA的RNA聚合酶（Sp6、T7和T4噬菌体RNA聚合酶）：该酶为转录中的RNA合成酶，识别DNA中各自特异的启动子序列，无需引物。用于单链RNA探针；合成mRNA用于体外蛋白质合成。核酸酶：Bal31核酸酶：主要活性为3外切核酸酶活性（Ca2+）,可从线性DNA两条链的3端去除掉单核苷酸，达到两头缩短DNA的目的，用于缺失突变，构建嵌套缺失

19、体；也可用来制作DNA限制酶切图；确定DNA二级结构和从单链RNA上去除核苷酸。S1核酸酶：可降解单链DNA或RNA,是一种单链核酸酶。产生带5-磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链，可用于分析DNA:RNA杂交体的结构，去掉突出的单链尾以产生平末端；降解发夹结构。绿豆核酸酶：与S1核酸酶相似，但更温和。脱氧核糖核酸酶I：可优先从嘧啶核苷酸的位置水解dsDNA或ssDNA。可在切口平移标记时在dsDNA上随机产生切口；在闭环DNA上引入单切口，将分子截短；在DNA酶足迹法中分析蛋白：DNA复合物；除去RNA样品中的DNA。核糖核酸酶A（RNaseA）:内切核酸酶，可特异攻击RNA上嘧啶残基的3端。可除

20、去DNA:RNA中未杂交的RNA；可用来确定DNA或RNA中单碱基突变的位置；除去DNA样品中的RNA。核糖核酸酶H（RNaseH）：可特异性水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，不降解单链核酸、dsDNA或dsRNA，主要用于在cDNA克隆时合成第二链之前去除RNA；或除去mRNA与Poly（T）退火后的Poly（A）尾巴。（1DDNA拓扑异构酶I：来自小牛胸腺，该酶通过瞬时破坏并再生磷酸二酯键，解除共价闭合环dsDNA中的超螺旋，对DNA的超螺线度不敏感，在EDTA下仍有活性。（12）其他酶类：尿嘧啶-DNA糖基化酶，可将含尿嘧啶的单链或双链DNA中的尿嘧啶水解出来，去除尿嘧啶碱基后的D

21、NA片段不能再作为DNA聚合酶合成DNA的模板；Cre重组酶：是噬菌体P1的I型拓扑酶，可催化DNA在两个loxP位点之间发生特异性重组；蛋白酶K：可水解范围广泛的肽键，能有效降解内源蛋白，快速水解细胞裂解物中的DNA酶和RNA酶，以利于完整DNA和RNA的分离；溶菌酶：水解细菌细胞壁中肽聚糖的酶，常用于破碎细胞。8.T4DNA聚合酶有哪些作用？答：T4噬菌体DNA聚合酶来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，具有5f3DNA聚合酶活性和3*5外切核酸酶活/11f性，与KlenowDNA聚合酶活性相似，但其3外切酶活性更强。由于其53合成DNA和35降解DNA是一对方向相反的可逆反应，在高浓度dNTP

22、存在时，反应朝向合成方向进行，可以补平3凹端，如果使用带标记的dNTP,则可对DNA进行末端标记；当dNTP浓度合适时，又可切割突出的3末端，形成平末端；不添加dNTP时，由于其3外切酶活性，可以切割3端核苷酸，用来制造黏性末端。该酶在诱变反应中更有用，可使诱变率提高1倍。作为载体，应具备哪些特征？答：（1）能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制（具备复制原点）；（2）有合适的选择标记基因和筛选标记基因，理想的载体应该有两种选择标记基因；（3）具有合适的限制性内切酶位点（有多克隆位点）供外源DNA片段插入；（4）有较高的拷贝数，便于载体的制备；（5）容易从宿主细胞中分离纯化。如何构建穿梭载体、

23、表达载体和整合载体？答：穿梭载体是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体，这类载体主要是质粒载体，并至少含有两套复制单元和两套选择标记，相当于两个载体的联合。穿梭载体一般在大肠杆菌中保藏、扩增，然后将其转到目标宿主中，在目标宿主中所起的作用由其所携带的功能元件决定。表达载体首先具有克隆载体的基本骨架，除了复制起点、合适的克隆位点和标记基因外，还有表达元件：（1）强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因有效地转录；（2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进蛋白翻译；（3）在外源基因插入序列的下游区要有一个

24、强转录终止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳定性。还可以加入与分离纯化有关的序列如GST系统，或加入信号肽序列帮助目标蛋白分泌到胞外。整合载体：涉及将某个基因或某些基因插入到染色体中去的载体称为整合载体，按其作用方式不同可分为：目标基因的插入或敲除以及构建随机突变体库。基因插入/基因敲除：同源重组整合载体是最常用的整合载体，该载体一方面含有大肠杆菌克隆载体的骨架，更主要的是含有一段便于同源重组的重组DNA片段。也就是从染色体上待插入位点处取出一段DNA,将选择标记基因和多克隆位点插入到这个片段中间得到这一重组DNA片段。随机插入突变载体：随着功能基因组研究的发展，不断需要一系列发生基因

25、突变的材料。随机突变体库是指标记基因在载体的携带下通过DNA重组事件随机插入基因组中而形成的突变体的集合。为了提高标记基因插入到基因组中的频率，一般都要借助转座子来帮忙。通过哪些技术可以获得某一插入位点基因侧翼的信息？答：当获得一段DNA后，若要得到与其相邻的未知DNA片段，可通过染色体步查来完成。染色体步查是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步获得或探知其相邻的未知序列或与已知序列呈共线性的目的序列的核苷酸组成的方法和过程。在经典的染色体步查方法中，主要是通过构建基因文库，采用一段分离自某一重组体一端的非重复DNA片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重组克隆。该方法相对比较繁琐，适合

26、长片段步查，而基于PCR的染色体步查技术相对而言则比较简便，适合于小片段步查。通过PCR技术进行的染色体步查方法大致分为3类：反向PCR：首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA，再将酶切后的DNA片段连接成环状分子，其中至少有一个环状分子含有完整的已知片段，根据已知片段两端的序列设计反向引物，可将邻近的DNA片段扩增出来。利用接头的PCR：该方法第一步先将基因组DNA用限制性内切酶切割，然后将序列已知的接头片段连接到酶切片段两端，以提供PCR需要的另一端引物。根据已知序列设计的引物和根据接头序列设计的引物，可以将已知序列侧翼的未知序列扩增出来；热不对称交错PCR（TAIL-PCR）

27、：其基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（specialprimer，简称sp1,sp2，sp3,约20bp）,用它们分别和1个具有低Tm值的/11 /11短的随机简并引物（AD,约14bp）相组合，以基因组DNA为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，通过分级反应来扩增特异引物，所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。通过哪些技术可以获得启动子或复制起始位点？答：含启动子活性的DNA片段的分离大体上有三种方法：鸟枪法克隆：将DNA随机片段直接克隆到无启动子的探针质粒pKO1上，其报告基因为催化定量反应的半乳糖

28、激酶结构基因galK,重组体转化到ga的E.coli,以半乳糖为唯一碳源的选择培养基进行筛选。凡是具有启动子活性的插入片段都有可能启动galK报告基因的表达，并使半乳糖在E.coli中发生糖酵解反应，重组克隆分泌红色素；非重组克隆呈乳白色。（2）酶保护法分离：根据RNA聚合酶与启动子区域的特异性结合原理设计。将E.coli基因组文库中的重组质粒与RNA聚合酶在体外保温片刻，然后选择合适的限制性内切酶切割，未与RNA聚合酶结合的同一重组质粒作酶切对照。如果试验质粒的酶切片段比对照质粒减少，则表明被钝化的酶切位点位于RNA聚合酶结合区域内，即该区域存在启动子结构。将这个区域的DNA片段亚克隆在启动

29、子探针质粒上，测定其所含有的启动子转录活性。（3）滤膜结合法分离：其原理是双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA-蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测的DNA片段与RNA聚合酶保温，转移保温复合物至膜上，温和漂洗薄膜，除去未结合RNA聚合酶的DNA片段，然后再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNA片段洗脱。一般来说，这种DNA片段在膜上的滞留程度与其同RNA聚合酶的亲和性（即启动子的强弱）成比例，然而这种强弱难以量化，仍需将其克隆在探针质粒上进行检测。如何构建大肠杆菌严谨控制表达系统？PET表达系统的原理答：Lac操纵子在无诱导物的情况下，负调节因子lacI基因产物与启动子下游

30、的操作基因紧密结合，阻止转录的起始。在诱导剂IPTG存在的情况下，与阻遏蛋白结合后，导致与操纵基因的结合能力降低而解离出来,lac操纵子的转录因此被激活。用tac启动子构建的表达系统称为Tac表达系统。为了能使Lac和Tac表达系统具有严谨调控，一种能产生过量的lacI阻遏蛋白的lacI基因的突变体lac被应用于表达系统。但在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录，还需在表达载体中插入lac基因以保证有较多的lacI阻遏蛋白产生。人们想到用阻遏蛋白lacI的温度敏感突变株lacI（ts）应用于Lac和Tac表达系统。这些突变体基因插入表达载体或整合到染色体后，均能使lac

31、，tac启动子的转录受到温度严谨调控，在较低温度（30C）时抑制，在较高温度（42C）时开放。可控性启动子的温度诱导和IPTG诱导在容积较小（15L）的培养基中容易实现，但对于20L以上的发酵罐而言，长时间在42C下诱导既耗费能源，诱导效果又不理想，因为从28C升温至42C往往需要几十分钟。大规模发酵过程中添加IPTG诱导物成本也较高。解决方案如下:涉及到比启动子的E.col工程菌的构建可采用双质粒表达系统:将CI阻遏蛋白合成置于已:；启动子控制之下，并克隆在一个低拷贝质粒上，从而保证CI阻遏蛋白表达不至于过量；第二重组质粒则含有比启动子控制的外源基因。当培养基中缺少色氨酸时，比；启动子打开，

32、CI阻遏蛋白合成，由比启动子介导的外源基因转录关闭；相反，当色氨酸大量存在时，巴：；启动子关闭，CI阻遏蛋白不再合成，比启动子开放并激活外源基因表达。从整体上看，外源基因虽然处于比启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温度进行诱导表达。如何实现将某一基因整合入染色体的特定位点，又如何检测该基因是否整合成功？答：整合方法：涉及将某个基因或某些基因插入到染色体中去的载体称为整合载体，按其作用方式不同可分为：目标基因的插入或敲除以及构建随机突变体库。基因插入/基因敲除：同源重组整合载体是最常用的整合载体，该载体一方面含有大肠杆菌克隆载体的骨架，更主要的是含有一段便于同源重组的重组DNA片段。也就是从染色

33、体上待插入位点处取出一段DNA,将选择标记基因和多克隆位点插入到这个片段中间得到这一重组DNA片段。随机插入突变载体：随着功能基因组研究的发展，不断需要一系列发生基因突变的材料。随机突变体库是指标记基因在载体的携带下通过DNA重组事件随机插入基因组中而形成的突变体的集合。为了提高标记基因插入到基因组中的频率，一般都要借助转座子来帮忙。基因定点整合技术又称为基因打靶是指构建含有同源序列的片段的整合载体，通过各种转化方法，使外源序列与靶序列之间发生同源重组，从而将靶序列定点破坏，通过一系列筛选手段，最终得到定向转化的细胞。检测方法：根据重组载体的标志进行鉴定：利用重组载体中的标记基因可以筛选获得阳

34、性重组子。如最常见标志耐药性标志，若外源基因插入在抗性基因外部，在含有抗生素的培养基中，只有携带相应耐药性基因载体的细胞才能生存繁殖，而未能接受载体DNA的细胞则全部被筛除掉。通过插入失活也可以进行筛选，质粒上具有两种抗性标记基因，当外源基因插入其中一个时，就会导致其失活，从而只能对另一种抗生素具有抗性，这样就以对抗生素是双抗还是单抗来筛选。还可以利用a-互补原理来筛选，以IPTG诱导X-gal底物显色选择，重组菌为白色菌落，非重组显蓝色。(2)DNA限制性内切酶图谱分析：目的序列插入载体会使DNA限制性酶图谱发生变化。利用这种变化可以鉴定插入序列。通常利用重组时的酶切割重组子DNA，若获得与

35、目的基因一致的片段即证明重组子中含有插入序列。利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定含有目的基因的阳性克隆。常用的杂交方法包括菌落原位杂交、Southern杂交。菌落原位杂交直接将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维素膜上，经碱裂解后，将菌落释放的DNA原位吸附在没上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的基因的菌落DNA上而不被洗脱，待显色后就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。PCR法：如果已知目的基因的长度和两端的序列，设计合成一对引物，以转化生长的质粒DNA为模板进行扩增，挑选出PCR产物，与预期长度相符的克隆，可能就是含有目的序列的重组子。免疫学

36、方法：通过特定的标记抗体与基因表达产物的反应指示含有目的基因的转化细胞，因而要求目的基因进入受体细胞后能够表达。利用标记抗体的酶可催化特定的底物反应而呈现颜色变化，可以指示含有目的基因的克隆位置。核酸序列测定：直接测序可以得知序列信息是否发生变化。绿色荧光蛋白(GFP)标记：通过检测绿色荧光蛋白来鉴定目的基因是否已经插入。凝胶电泳15.如何制备RNA探针、DNA探针？答：将需要制备的目的基因的一小段寡核苷酸序列，插入到含有T7或SP6启动子的载体上，并处于启动子下游；再利用限制性内切酶进行切割得到线性DNA分子，然后加入RNA聚合酶、NTP和标记物，进行体外转录得到标记的小分子RNA探针。这种

37、方法可以快速制备各种标记(同位素、非放射性标记均可)的小于lOOnt的小分子RNA探针，适用于Northern和原位杂交等。注意事项：(1)制备单链探针时的正应注意插入方向确性；(2)外源基因插入后应线性化。常见DNA探针制备方法则有缺口平移，随机引物法，单链探针，末端标记(Klenowfragment、T4DNA聚合酶标记3端、激酶标记5端、末端转移酶标记3端)等。影响基因表达的因素有哪些？答：影响因素有：启动子强度；转录终止子；诱导条件；培养条件；质粒拷贝数；转录起始序列；密码子偏爱性;mRNA结构(序列稳定性和半衰期)；寄主生理条件(蛋白酶活性)如何实现某一基因在异源宿主中的表达？答：首

38、先要考虑的是表达元件的组装：（1）选择合适的复制起点，翻译起始序列不同会影响起始效率；（2）报告基因；（3）启动子（强度，可控性，宿主专一性）；（4）SD序列：SD序列与起始密码子之间的精确定位；（5）密码子：宿主对密码子的偏爱性；（6）较强的终止子；（7）质粒拷贝数：高拷贝质粒数以保证mRNA的产量，进而提高合成速度。还要考虑异源蛋白在宿主中的定位，即可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中，或通过分泌方式运送到胞外。分别针对其不同特点，构建表达序列时应做相应的修饰。构建基因文库的基本策略：答：基因组DNA文库的构建程序包含5个部分：载体的制备；高纯度大分子量基因组DNA的提取；基因组DN

39、A的部分酶切与脉冲电泳分级分离；载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；重组克隆的挑取和保存。构建噬菌体文库如P1等的程序稍有不同，连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采用包装蛋白进行包装并侵染宿主。基因组DNA文库的载体制备：载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。高质量大分子量基因组DNA的提取和部分酶切：构建不同大小插入片段的基因组文库对DNA质量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的35倍。实践表明，提取的基因组DNA分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。III文库的连接转化或包装侵染：一般在构建大片

40、段基因组DNA文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白，同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的DNA的转化效率也有所不同。W.文库的质量检测：在文库的质量检测中，除了克隆子数目是可以确定的，其它值都是估算的。文库的平均插入片段长度是通过PFGE电泳检测一定数目的重组子的插入片段大小所得平均值。基因组覆盖倍数的计算方法一般包括两个过程，一是计算法，基因组覆盖倍数二平均插入片段长度x克隆数/基因组DNA的长度（一般

41、是约数）；另一种算法是结合基因组覆盖度的检测来进行的。基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。由于所使用的每个探针筛选的克隆数目即表明文库中对该基因位点的覆盖倍数，因此，基因组覆盖倍数又等于所有探针筛到的阳性克隆的总个数使用的总探针数的比值。（质量优良的基因文库的代表性与基因文库的大小，即克隆数多少呈正相关）。V.基因文库的扩增、分装及保存。cDNA文库的构建策略：细胞总RNA的提取和mRNA分离；第一链cDNA合成；第二链cDNA合成；双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。试述基因芯片、蛋白质芯片的工作原理：答

42、：基因芯片又称DNA芯片或DNA阵列，是将大量DNA探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，并与标记的样品分子杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中mRNA的表达量，也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定，为进一步了解基因间的相互关系及基因克隆提供有用的工具。蛋白质芯片是利用抗体与抗原结合的特异性即免疫反应来构建的，首先选择一种能够牢固地结合蛋白质分子（抗原或抗体）的固相载体，在上面按预先设计的方式固定大量蛋白质（抗原或抗体），形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片，然后加入与之特异性结合的带有特殊标记的蛋白质分子（抗原或抗体），通过对标记物的检测来实

43、现抗原抗体的检测，即蛋白质检测。/11试述酵母双杂交系统、单杂交系统：答：酵母双杂交系统是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。反式转录激活因子，往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合功能域(BD)和转录激活结构域(AD)。这两个结合域将它们分开时不能激活相关基因的转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间距离上较为接近时，才能形成有功能的转录因子，从而启动下游基因的转录。根据这个特性，将编码3D的基因与已知蛋白X的基因构建在同一个表达载体上，形成融合蛋白BD-X，并以含有BD-X融合蛋白和报告基因的细胞为构建文库的受体菌；而将编码AD的基因

44、和目的蛋白Y的基因构建融合基因文库，产生融合蛋白AD-Y。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，表达两者的融合蛋白。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活含有BD结合位点的启动子下游报告基因的表达，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落，研究活细胞内蛋白质相互作用。酵母单杂交技术是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子，研究表明GAL4的DNA结合结构域可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)；而激活结构域可与RNA聚合酶或转

45、录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和激活结构域可完全独立地发挥作用。据此，可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要它能与我们想了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。正是基于这一理论，酵母单杂交系统由2部分组成：將文库蛋白片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒；含有目的基因和下游报告基因的报告质粒。在实验中，首先将报告质粒整合入酵母基因组，产生带有目的基因的酵母报告株；再将文库质粒转化入报告株；若存在文库蛋白与目的基因的相互作用，可通过对报告基因的表达将文库蛋白的基

46、因筛选出来。简述PCR在基因操作中的应用：答：(1扩增未知DNA片段：当获得一段DNA后，若要得到与其相邻的未知DNA片段，可通过染色体步查来完成。通过PCR技术进行的染色体步查方法大致分为3类：反向PCR；利用接头的PCR:热不对称交错PCR(TAIL-PCR)。反转录PCR(RT-PCR)以反转录的cDNA作为模板所进行的PCR反应，可用于测定基因表达的强度，还可用于鉴定已转录序列是否发生突变，呈现mRNA多态性，克隆mRNA的5和3末端序列，以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。该技术已演变成特殊的PCR技术口：DNA末端的快速扩增(RACE)；差异显示PCR(DD-PC

47、R)。通过PCR扩增在扩增DNA产物末端引入限制性核酸内切酶酶切位点。用于PCR扩增的寡核苷酸引物的5末端区域内部常被设计相应的内切酶酶切位点。在许多情况下，两个引物的内部被设计不同的酶切位点。通常扩增产生的靶片断的双末端被引入新的酶切位点经酶切消化后的扩增片断能定向克隆至相应的质粒载体上。多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。多重PCR可用于等位基因的鉴定，若在一个品种中多个相似基因共存，可设计一系列引物对其进行鉴定，对每种类型的基因设计特异性的PCR引物，使扩增产物的大小彼此不同，从而可以通过扩增产物的相对分子质量来判断样品中所含的基因类型。随机扩增多态性DN

48、A(RAPD)：用长度为10个或11个碱基的单一固定序列引物可扩增出随机大小的DNA片段，产生DNA片段的多态性，也就是DNA指纹。扩增片段长度多态性(AFLP)：扩增长度片段多态性分析是针对基因组DNA的限制性酶切片段进行选择性PCR扩增而建立DNA指纹的技术。首先将基因组DNA以两种限制性内切酶完全切割，之后再将合成的并与这两个限制酶产生的末端相对应的接头与酶切DNA片段的两端连接。然后以含有接头序列和酶切位点序列的引物对连接产物作PCR扩增。最后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR产物进行分离，从而产生DNA指纹。荧光实时定量PCR：利用特定设计的PCR仪器检测PCR扩增过程中标记的荧光信号的

49、累积来实时监测整个/11PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。克隆在原核载体的DNA片段的快速鉴定。已转化的重组载体的细菌细胞或者噬菌体颗粒可通过直接从培养皿上挑取菌落或噬菌斑获得，然后直接加入到PCR混合液中，这时PCR混合液中除了未加热稳定DNA聚合酶外的所有试剂，其中引物与所要鉴定的已克隆DNA片断的侧翼序列互补。将PCR反应混合液加热煮沸几分钟，使DNA模板从细菌细胞或者噬菌体颗粒中释出，并使核酸酶和蛋白酶失活。然后，加入一种热稳定DNA聚合酶于反应液中，进行标准PCR的约30个循环的扩增反应。PCR扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，DNA序列予以确证以及southern

50、杂交和酶切图谱分析鉴定等。（此外，还有不对称PCR、标记PCR、加端PCR、锚定PCR、核酸的基础研究、序列分析、检测基因表达、从cDNA库中放大特定序列、研究已知片段邻近基因或未知DNA片段、进化分析、医学应用诊断单基因遗传疾病、分析生物学证据、性别控制、转基因检测等等应用。）引物设计应遵循哪些原则？答：引物长度应为1530个核苷酸，Tm接近72C较佳。Tm=（G+C）*4+（A+T）*2引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。引物中碱基的分布应当是随机的，避免出现一连串的单一碱基或产生二级结构。G+C碱基的含量在4060%之间。两个引物在3端均必须与模板互补，5端可以不互补。引物自身连续

51、互补碱基小于4个。引物之间连续互补碱基亦应小于4个。引物5端可以修饰。引物3端不可以修饰。引物3端要避开密码子的第3位。若获得某一有价值的蛋白质，如何对其进行深入研究？答：首先进行常规理化性质检测，分析其分子量大小测定方法：渗透压、沉降平衡、凝胶过滤层析、激光解吸电离飞行时间质谱）；等电点测定（方法：溶解度法、等电聚焦）；末端氨基酸残基测定（N端和C端氨基酸测定方法分别有二硝基氟苯法、丹磺酰氯法、异硫氰酸苯酯法和肼解法、羧肽酶法）；蛋白质分子中的糖链（血球凝集反应、糖蛋白电泳、糖组分色谱分析）。然后再测定其一级结构（方法有Edman化学降解法、酶降解法、质谱法、根据核苷酸序列推定法；将得到的该蛋白质序列提交蛋白质数据库与其他已知的序列进行比对，确定是否有同源蛋白质存在，根据其同源结构预测该蛋白质的二级和三级结构。若无同源蛋白质发表，也可利用X射线结晶、冷冻电镜术、核磁共振技术确定其构象。在得知其预测结构后，可利用定点突变技术来研究蛋白质结构与功能的关系。有哪些技术可以检测转录水平和翻译水平的差异？答：转录水平：