PCR测定中常见问题分析

1、PCR测定中常见问题分析 卫生部临床检验中心 王露楠结果不准确 问题出在哪？标本的采集与储存样本的制备-核酸纯化试剂准备、加样逆转录、扩增、检测结果分析报告解释标本的采集与储存1. 采集的容器2. 储存条件-HBV DNA 2-8C 室温（25 C ） 标本的采集与储存2.储存条件-HIV RNA 2-8C 室温（25 C ）标本的采集与储存3. 检测前及检测后样本的储存-血清样本 HBV DNA 检测前 1周内检测 2-8C 1周以后检测 -20C 检测后 -20CHCV RNA 检测前 24hr内检测 2-8C 24hr后检测 -20C 检测后 -20C/ -70C样本的制备-核酸纯化 核

2、酸提取方法 人员操作 仪器设备状态 样本量 样本的制备-核酸纯化一般原理：均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。一般步骤：去垢剂裂解-蛋白酶处理-有机溶剂提取-乙醇沉淀等步骤。纯化目的：核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。 1. 核酸提取方法样本的制备-核酸纯化纯化质量评价：抑制物的去除 来自样本-血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸酶等。 来自提取过程-乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐

3、酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂 。保证措施：对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施；核酸提取及扩增有效性的质控样本的制备-核酸纯化2. 人员操作 加样的准确 避免交叉污染 振荡的幅度、时间 温育的温度、时间 样本的制备-核酸纯化3. 仪器设备状态 离心机 金属浴/水浴 加样器 全自动样本处理系统样本的制备-核酸纯化4.样本量50l 样本 灵敏度500IU/ml 200l 样本 灵敏度50IU/ml?试剂准备、加样试剂配制的均一性、分装的均一性常用试剂的分装、储存及使用容器加样准确性和重复性 加样量逆转录、扩增、检测1. 逆转录 影响因素：逆转录酶的活性 逆转录的温度 操作的细节 如何发

4、现问题：质控逆转录、扩增、检测2. 扩增、检测 影响因素：引物、探针、仪器设备状态 扩增效率：结果分析定量的原理结果分析1. 标准化问题1997: 1st international Standard for HCV (96/790) 50,000 IU per vial, genotype 1a1999: 1st international Standard for HIV-1 (97/656) 100,000 IU per vial, genotype B1999: 1st international Standard for HBV (97/746) 500,000 IU per via

5、l, genotype A2000: 1st international Standard for B19 (99/800) 500,000 IU per vial2002: 1st international Standard for HAV (00/560) 50,000 IU per vial2002: 1st international Reference panel for HIV-1 Genotypes (01/466) genotypes A-H no unitage assigned2005: HBV DNA GBW(E)090031 1.03106 IU/ml HCV RNA GBW(E)090032 1.29105 IU/ml结果分析 关于IU/ml和copies/ml的换算结果分析2. 扩增曲线的分析结果分析结果分析结果分析结果的解释PCR可以给出我们想要的答案吗?结果的报告解释是