实验操作细节和技巧

1、实验操作细节和技巧中心实验室管理部赵艳君2010-11-261主要内容实验前的准备 实验过程中的规范操作 实验结束后的整理 2一、实验前的准备实验前需确认的工作：人员能力的确认：知识、技能、经验仪器设备的确认：计量、状态 物料的确认（试剂和耗材）：数量、规格、级别、有效期 方法的确认：SOP、说明书 环境的确认： 温度、湿度、压差、洁净度 3二、实验过程中的规范操作 （一）溶液配制（1M Tris PH8.0 100ml ）Tris纯化水 量取称重溶解、混匀、调pH定量过滤粘签储存4工作前准备实验用水：饮用水、纯化水、超纯水试剂准备：Tris、PH校准液、1N HCL配制器具、耗材：烧杯、量筒

2、、漏斗、滤纸、试剂瓶。仪器：天平、PH、磁力搅拌器配制方法：SOP5操作1.称重：称重：其精确度可根据数值的有效数位来确定。如称取“0.1g”,系指称取重量可为0.06-0.14g；称取“2g”, 系指称取重量可为1.5-2.5g; 称取“2.0g” 系指称取重量可为1.95-2.05g; 称取“2.00g” 系指称取重量可为1.995-2.005g;6操作精密称定：系指称取重量应准确至所称重量的千分之一；称定：系指称取重量应准确至所称重量的百分之一；称量注意事项：选择与称量重量、精度相符的天平。天平是计量仪器，使用前确认一下水平、计量有效期。7操作2.量取精密量取：系指量取体积的准确度应符合

3、国家标准中对该体积移液管的精密度要求。量取：系指可用量筒或按照量取体积的有效数位选用量具。 8操作量取注意事项：无标识或标识不清楚的试剂不要使用。需要从大瓶液体试剂吸取少量时，应分装到小瓶中。从试剂瓶中倾倒液体后，注意擦拭瓶口。93.溶解：磁力搅拌器、加热溶解。4.混匀：指弹、上下颠倒混匀、用枪吹打、旋涡振荡混匀（Vortex）、血浆混匀器。5.调PH：校准试剂或配制试剂恢复到室温后再进行测量。边搅拌边调整时，注意保护电极。使用前校准，并确定计量有效期。操作10操作6.定量：根据配制溶液的要求选择适合的量筒、容量瓶。容量瓶、瓶盖配套使用。量筒、容量瓶属计量器具,根据需要安排计量。11操作容量瓶

4、计量要求标称容量/mL 25 50100 200 500 1000 容量允差/mL 0.03 0.05 0.10 0.15 0.25 0.40 12操作量筒计量要求标称容量/mL 25 50100 200 500 1000 容量允差/mL 0.500.501.0 2.0 5.0 10 13操作7. 过滤：滤纸滤膜：水性0.22um、0.45um 油性14操作8.贴签标签需包含内容：试剂名称浓度体积批号或配制日期配制人、复核人有效期储存条件15操作9.储存条件室温：系指10-304：系指2-8-20：系指-15- -2516（二）PCR扩增体系的配制PCR扩增引物的配制流程图引物干粉纯化水引物干

5、粉离心定量溶解配制所需浓度分装储存17引物的溶解与定量1.离心：引物干粉12000 rpm离心5 min； 2.溶解：按理论加水量加水溶解并振荡混匀，室温（10-30）溶解2小时（或4 过夜溶解），振荡并瞬时离心；或65加速溶解10min。 计算引物定量至50 M的理论加水量： 理论加水量（l）=合成OD数 g/OD 分子量 50 106 18引物的溶解与定量寡核苷酸 1OD260=33g/ml单链核糖核酸（RNA） 1OD260=40g/ ml双链核糖核酸（DNA） 1OD260=50g/ ml3.定量：取2l用紫外分光光度计定量，得到实际浓度（ng/l） 。19引物的溶解与定量4.配制所需

6、浓度：计算引物定量至50 M 需要的补水量： 补水量（l）=实际浓度分子量103（实际加水量-2） 50 -（实际加水量-2） 补水后振荡混匀并瞬时离心，得到50 M 的引物有效液。 5.分装储存：-205储存。 20练习题例：已知一条探针的序列（5-3）为GTCAGCTCACTCAACGTGTTTTTTTTTTTTTTT，合成规格为5OD/管，合成数量1管，分子量为10022.43，若将此管探针溶成浓度为50M，理论需加水多少l？21答案理论加水量（l）=合成OD数 g数/OD 分子量 50 106 533 10022.43 50 106 329.26 22PCR检测实验室的分区PCR扩增工

7、作分区： 试剂贮存和准备区 ：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。 样本制备区：临床标本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。 扩增区：DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液 产物分析区：扩增片段的测定,杂交、电泳。23PCR检测实验室的分区不同区域的物品做到专区专用，严禁相互交叉使用。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有

8、明显区别标志的工作服，以便于鉴别。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。24操作细节样品从冰箱取出，待室温融化后，混匀离心。 在待用样品管上做好标记，标记时要注意管/板的方向，比如：1.5离心管，总以开盖方向为正。50ml样品管，总以管盖方向为左，从左到右编写。管盖和管身都要写标号，对于排管，还要区分管盖的前后位置。 25操作细节样品管的码放顺序，要与加样顺序一致。使用后的样品管与未使用的样品管要分开摆放。通用的试剂应统一、优先加入，减少污染。每次扩增应加入阳性、阴性对照品，同时考虑到分装时的损失，应多配出1-2个反应体系。26操作细节选择与PCR仪相配套的PCR扩增管/板，PCR

9、扩增管/板的种类很多，要有所了解。 使用排枪分装时，吸液后一定要检查液面的高度是否一致，有无漏吸、吸液不准的现象，排液后检查液体是否排空。 使用完后的离心管，要盖严管盖，扩增反应液底部不应有气泡，扩增前短暂离心。样品管的储存一定放在储存盒内。27PCR仪的使用放置样品时，应尽量选择对称放置，放置样品量少时，应放入PCR仪自带的样品支架，通过样品管盖的不同（平盖或鼓盖）选择支架的方向。程序运行前要检查一下程序的设置。使用多头扩增仪时，启动或停止扩增程序时，选择的顺序要与实际顺序相一致。 28PCR仪的使用不建议使用4度过夜的功能。定期清洁样品孔和上加热盖。定期对PCR仪的扩增效果进行验证。一年至

10、少一次清洁PCR内部（由维修工程师完成）。29（三）无菌操作1. 实验进行前，超净工作台以紫外灯照射1520分钟灭菌，以70 %ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作台面，紫外灯照射1520分钟。30无菌操作2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如移液器、试管架、吸管吸取器或吸头盒等可以放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流流通。实验用品以70 % ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。31无菌操作3.小心

11、取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。32无菌操作4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级的生物安全柜操作(至少Class II)。 33无菌操作注意事项：一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。不要做到一半，又出工作间拿东西，这样增加了污染的机会。 整个操作要快、动作要轻、而且不要干其他的事情。比如手机响了，最好不要接。34无菌操作培养的试剂一定要用自己的。既不要借别

12、人的，也不要借给别人。由于每个人的操作行为、用途是不一样的，相互之间串用，很容易造成交叉污染。定期检查CO2 钢瓶的压力、CO2 培养箱35无菌操作CO2 浓度、温度、及水盘是否有水？ (水盘的水用无菌水，每周更换)。 超净工作台应定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜。 36实验结束后的整理实验结束后的清场内容定期扫除的内容其他值得注意的细节37 实验后的清场内容实验台面设备清洁下次实验准备实验记录填写38 实验后的清场内容实验台面物品收纳：将所使用的物品放回原处，码放整齐，有序。需要洗刷再使用的器皿，用后先用清水冲洗，去除表面的污渍，放在指定的地方待中心实验室回收清洁。台面清洁：清洁实验过程中

13、遗撒的污渍，将实验后台面、超净工作台内的垃圾及时处理。椅子应插入桌子的下方。废弃物处置：台面上（包括工作台、通风橱中）的小垃圾桶中的垃圾按类丢弃或上交。39 实验后的清场内容设备清洁使用过的仪器设备要进行清洁：如天平、离心机。检查仪器是否关闭，使用记录是否登记。40 实验后的清场内容实验记录的填写实验记录应填写及时，填写方式和内容需符合公司关于实验记录本的管理规定。下次实验的准备下次需使用的实验试剂及耗材应提前清点，及时配制或申请采购，以免影响别人及自己使用。41 定期扫除的内容清扫一切垃圾、灰尘、脏污。自己动手而非清洁工，清除陈年老灰，不留死角：地板/墙壁/天花板/灯罩。清扫点检设施、用具，

14、清理冰箱（除霜、清理样品）更换水浴锅水质、清理实验用品，重新摆放和标示。42关于物品的有序性更衣柜 更换工作服后，衣柜门不关！ 随手关门！ 工作服和个人衣物混放；不同区域专用工作服混放！ 专柜专用！43关于物品的有序性抽屉 使用后未彻底关闭！ 随手关抽屉！ 物品混乱放置！ 分类收纳、标识清晰！44关于物品的有序性实验用品 随意堆放！放在专区中，有序摆放。易损坏的物品要有防护措施！45关于物品的有序性垃圾桶 直接使用，且没有定期清洁！应在垃圾筒内套上一个塑料垃圾袋，定期清洗垃圾筒！46各种安全隐患消防安全隐患 随意堆放！实验用品不应直接放在地上，应放在实验台内部或台面废弃的易燃物品应该及时处理！47各种安全隐患化学品安全 存放无防护！危险品的运输、存放要有防护措施！ 标识不清或