DB32-T 4016-2021羊李斯特菌病诊断技术-（高清现行）

1、ICS65.020.30CCS B 43DB32江苏省地方标准DB 32/ T 40162021羊李斯特菌病诊断技术Diagnosis for goat and sheep listeriosis2021 - 03 - 04 发布2021 - 04 - 04 实施江苏省市场监督管理局发 布DB32/T 4016-2021前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由扬州大学提出。本文件由江苏省畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：扬州大学、江苏省动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：殷月兰、焦新安、董永毅、陈祥、黄金林。

2、羊李斯特菌病诊断技术范围本文件规定了羊李斯特菌病的临床诊断、病理学诊断和实验室诊断的技术要求。 本文件适用于羊李斯特菌病的诊断。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，凡是注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.30 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验GB 19489 实验室生物安全通用要求。术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1李斯特菌病 listeriosis由李斯特菌引起人和动物的一种重要的人兽共患传染病，呈散发或暴发发生

3、，主要表现为脑膜炎、 败血症和怀孕母羊流产。3.2李斯特菌溶血素O listeriolysin O, LLO单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的主要毒力因子，对真核细胞膜具有裂解活性。临床诊断单核细胞增生李斯特菌引起羊李斯特菌病的临床症状为脑膜脑炎、败血症和流产。发病初期，羊体 温升高12，采食、咀嚼、吞咽困难，头颈呈一侧性麻痹，弯向对侧，做转圈运动。角弓反张，昏 迷卧于一侧，直至死亡。病程短的2 d3 d，长的1至3周或更长时间。妊母羊流产，羔羊常发生急性败血症而很快死亡。伊氏李斯特菌引起羊李斯特菌病的临床症状为胃肠炎、新生羊败血症和怀孕母羊流产，罕见病例呈 脑膜脑炎相关的临床表现。病理诊断

4、眼观病变眼观病变表现如下：a） 神经症状的病羊：脑及脑膜充血、水肿，脑脊液增多，稍浑浊； b） 败血症型的病羊：肝脏呈多灶性坏死，脾脏肿大，心外膜下出血； c） 流产母羊：有胎盘炎，子宫内膜和胎盘充血及广泛坏死。组织病理学变化血液中白细胞总数升高，单核细胞增多，炎性细胞灶及其邻近的血管周围呈套袖现象，占主导的细 胞是淋巴细胞、组织细胞、浆细胞；脑干嗜中性粒细胞液化。实验室诊断细菌学诊断细菌分离和培养无菌采取病羊的脑脊髓液、脑、肝、脾、心、肺和肾组织，置于放有冰袋的采样箱中（温度低于10）于 24 h 之内运回实验室，直接涂片镜检，取样品直接接种到科玛嘉平板上于 37培养 24 h，同时按照附录

5、 A 的方法进行增菌和鉴定；或按照 GB 4789.30 推荐的方法进行增菌，转接到牛津琼脂平板上，放置在 37培养，培养至 24 h 和 48 h 检查细菌培养情况。菌落形态及革兰氏染色菌落形态：李斯特菌在脑心浸液平板上培养24 h后，形成直径约为1 mm2 mm的乳白色菌落，边缘整齐、表面光滑、隆起度高，粘稠、易挑起（附录A中图A.1）。在科玛嘉培养基上形成的菌落呈蓝绿色，菌落周围有白色晕环（见附录A中图A.2）。在含七叶苷的琼脂培养基（如MOX平板）上形成的菌落呈黑色（见附录A中A.3）。革兰氏染色镜检：革兰氏染色阳性的小杆菌，两端钝圆，排列成“V”型或并列排成栅栏状。生化特性根据菌落特

6、征选取5个菌落，观察细菌形态及在血琼脂上培养后的溶血活性，测定细菌发酵葡萄糖、 麦芽糖、甘露醇、鼠李糖和木糖及水解七叶苷的能力。单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的生化特征如表1所示。表1 李斯特菌的生化特征菌种葡萄糖麦芽糖甘露醇鼠李糖木糖七叶苷-溶血反应协同溶血反应单核细胞增生李斯特菌+-+*-+-*伊氏李斯特菌+-+*血清型4h的单核细胞增生李斯特菌不能利用鼠李糖*血清型4h的单核细胞增生李斯特菌协同溶血反应呈阳性*在划线有马红球菌的血平板上呈铲型溶血（见附录A中图A.4）毒力鉴定将强毒菌株以1106 CFU腹腔注射小鼠后，小鼠14天内死亡。小鼠脾脏、肝脏、淋巴结、肺脏、肾上腺、心肌、胃肠

7、道中有较小的坏死灶。取心血、肝、脾直接做涂片，镜检出现大量呈“V”型或栅栏状的革兰氏阳性杆菌。分子生物学诊断挑取细菌的菌落作为PCR 的模板，用属特异性引物 PCR 扩增出 370 bp 的条带判定为李斯特菌属； 用单核细胞增生李斯特菌特异性引物 PCR 扩增出 660 bp 的条带判定为单核细胞增生李斯特菌；用伊氏李斯特菌特异性引物 PCR 扩增出 1100 bp 的条带判定为伊氏李斯特菌（附录 B）。血清学诊断以李斯特菌溶血素 O 作为包被抗原、羊血清样品作为第一抗体、酶标兔抗羊 IgG 作为第二抗体， 建立间接 ELISA 检测的血清学方法，应用于流行病学调查，具体操作和判定方法见附录

8、C。结果判定综合临床诊断、病理学诊断及实验室诊断结果，报告羊是否发生李斯特菌病。患病动物表现神经症 状、败血症或流产、体温升高，血液中单核细胞增多，可疑为李斯特菌病。进一步从病死羊中分离鉴定 出单核细胞增生李斯特菌或伊氏李斯特菌，可以确诊；若未分离到李斯特菌，但患病一周后的羊血清间 接ELISA测定结果阳性，也判定羊患有李斯特菌病。安全措施按照GB 19489执行。附 录 A（规范性）李斯特菌的分离与鉴定取 10 g 固体样品或 10 mL 液体样品（包括血液样品）放入 90 mL LEB 增菌液中（纱布、棉签直接放入），30培养 16 h。然后用接种环取培养液在科玛嘉显色平板上划线，37培养

9、 24 h。选取带白色晕环的蓝绿色菌落在脑心浸液培养基（BHI）平板上纯化培养，单菌落用于后期的进一步鉴定。图 A.1 脑心浸液培养基（BHI）上的单核细胞增生李斯特菌菌落图 A.2 科玛嘉平板上的单核细胞增生李斯特菌菌落图 A.3 MOX 平板上的单核细胞增生李斯特菌菌落图 A.4 血平板上的李斯特菌与马红球菌的协同溶血试验（图 A1、A.3 和 A.4 为伊氏李斯特菌；图 A.2 为单核细胞增生李斯特菌）附 录 B（规范性）PCR 方法鉴定李斯特菌PCR 引物李斯特菌属鉴定引物：PseF：5-GCTGAAGAGATTGCGAAAGAAG-3 PseR：5-CAAAGAAACCTTGGATT

10、TGCGG-3扩增产物长度为 370 bp单核细胞增生李斯特菌鉴定引物： LisB：5-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3 MonoA：5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3 扩增产物长度为 660 bp伊氏李斯特菌鉴定引物:LisB：5-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3 Iva1：5-CTACTCAAGCGCAAGCGGCAC-3扩增产物长度为 1100 bpPCR 扩增以细菌的基因组为模板，利用引物 PseF 和 PseR 首先对分离菌株进行李斯特菌属的鉴定。PCR 反应体系（50 L）：超纯水 34.6 L，10Buffer（含 Mg2+）5 L，d

11、NTP 4 L，rTaq 酶 0.4 L，上下游引物各 2 L，模板 2 L；PCR 反应条件：94 5 min；94 50 s，55 1 min，72 1 min，30 个循环； 72 10 min。反应结束后，扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，分离株鉴定为李斯特菌属后，继续用 2种引物（MonoA 和 LisB）和（Ival 和 LisB）分别进行种鉴定，PCR 反应体系如下：超纯水27.75 L10PCR 缓冲液5 LdNTP (2.5 mM)5 LMonoA、Iva1各 2 LLisB4 LrTaq DNA 聚合酶0.25 LDNA 模板4 L总的反应体系50 L在对李斯特菌进行

12、 PCR 的过程中，若以菌落为模板做 PCR，则 DNA 模板体积为 0，以超纯水补齐不足部分的反应体系。细菌的加入方法为：用灭菌牙签挑取菌落，转移至加有 50L 反应混合液的 PCR管中与管壁轻轻摩擦和搅动。PCR 反应条件为：94 5 min；94 50 s，58 1 min，72 1 min，30个循环；72 10 min。反应结束后，产物用 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。反应的体系与条件参照李斯特菌属鉴定，其中退火反应设为 58 ，1 min。用属鉴定引物 PCR 扩增出 370 bp 的条带判定为李斯特菌属；用单核细胞增生李斯特菌鉴定引物 PCR 扩增出 660 bp 的带判定为单核细

13、胞增生李斯特菌；用伊氏李斯特菌鉴定引物 PCR 扩增出 1100 bp 的条带判定为伊氏李斯特菌。结果判定若扩增出 370 bp 左右的条带，则对应菌株鉴定为李斯特菌属的细菌，如图 B.1 泳道 1 和 2 所示。在扩增出李斯特菌属特异性条带的前提下，若扩增出 660 bp 的条带，如图 B.2 第 1 泳道所示，则为单核细胞增生李斯特菌；若扩增出 1100 bp 的条带，如图 B.2 第 2 泳道所示，则为伊氏李斯特菌。图 B.1 李斯特菌属鉴定 PCR 扩增结果图 B.2 单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌种 PCR 扩增结果附 录 C（规范性）间接 ELISA 方法检测抗 LLO 的血清抗体用 0.05 mol/L pH 9.6 碳酸盐缓冲液将 LLO 蛋白稀释，包被于 96 孔板中，包被量为 0.5 g/孔，于4过夜吸附。次日用 PBST 洗涤 3 次5 次，每次 5 min，拍干。然后用 1% BSA 封闭，每孔 200 L，37作用 2 h，洗板同上。加入待检血清（用 PBST 1:400