DB32-T 4139-2021小麦赤霉病菌对常用杀菌剂抗性监测-（高清现行）

1、ICS 65.020.20CCS B 22DB32江苏省地方标准DB 32/ T 41392021小麦赤霉病菌抗药性监测技术规程Technical regulation for monitoring of fungicide resistance in Fusarium spp. causing wheat head blight2021 - 11 - 04 发布2021 - 12 -04 实施江苏省市场监督管理局发 布DB32/T 4139-2021I前言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由南京农业大学提出。本文件由

2、江苏省农作物标准化技术委员会归口。本文件起草单位：南京农业大学、江苏省植物保护植物检疫站。本文件主要起草人：周明国、侯毅平、段亚冰、王建新、张绍明、朱阿秀。DB32/T 4139-2021 PAGE 4小麦赤霉病菌抗药性监测技术规程范围本文件规定了小麦赤霉病菌抗药性监测对象、敏感性基线确定、采样与分离、敏感性测定等技术要求。本文件适用于小麦赤霉病菌对常用杀菌剂抗性监测。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 1156.1200

3、6 农药室内生物测定试验准则 杀菌剂第 1 部分：抑制病原真菌孢子萌发试验 凹玻片法NY/T 1156.22006 农药室内生物测定试验准则 杀菌剂第 2 部分：抑制病原真菌菌丝生长试验 平皿法NY/T 1859.1 农药抗性风险评估第 1 部分：总则NY/T 1859.6 农药抗性风险评估第 6 部分：灰霉病菌抗药性风险评估术语和定义NY/T 1859.1 和 NY/T 1859.6 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1区分剂量 critical concentration能够鉴别抗药性菌株和敏感菌株的药剂浓度。监测对象监测对象包括：苯并咪唑类杀菌剂：多菌灵、甲基硫菌灵麦角甾醇生物合

4、成抑制剂：戊唑醇、丙硫菌唑、叶菌唑、丙环唑、三唑酮、咪鲜胺、己唑醇、 氟环唑、苯醚甲环唑甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂：嘧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌酯、烯肟菌酯、肟菌酯琥珀酸脱氢酶抑制剂：氟唑菌酰羟胺、萎锈灵肌球蛋白抑制剂：氰烯菌酯多作用位点杀菌剂：福美双、百菌清敏感性基线确定按照 NY/1859.6 执行。采样与分离采样小麦收获前在多个代表性监测点采集赤霉病发病的麦穗，或在小麦抽穗前 20 至 25 天采集含病残体的稻桩。采集的每个样本分别装入 1 个纸质信封，并记录采样人及联系方式、采样的小麦品种、用药情况及地点（省、市县、乡镇、村、组、农户）。做好记录并将样品晾干防止霉变。分离挑取稻桩上的病残体或麦

5、穗上的病麦粒，放在含有 50 g/mL 五氯硝基苯和 100 g/mL 硫酸链霉素的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，Potato Dextrose Agar）平板上，分离小麦赤霉病菌。敏感性测定药剂配制将有效含量90%以上的杀菌剂原药溶解在合适的溶剂中，制成10 mg/mL的母液，现配现用。测定方法菌丝生长速率测定法本方法适用于监测对所有登记药剂的抗药性。将分离的小麦赤霉病菌接种至含区分剂量药剂培养基 上，25黑暗培养 3 天，观察菌株生长情况，能生长的即为抗性菌株，不生长的即为敏感菌株。具体步骤按照 NY/T 1156.22006。孢子萌发测定法本方法适用于监测对甲氧基丙烯酸酯类和琥珀酸脱氢酶抑制

6、剂类杀菌剂的抗药性。制备各菌株的分 生孢子或子囊孢子，用无菌水稀释至约 104-5 个/mL 孢子液，吸取 100 L 孢子液均匀涂布在含有不同药剂浓度的水琼脂平板上，在 25C 下黑暗培养 6 至 8 小时（对照萌发 95%时），显微镜下检查孢子的萌发率（芽管长度达孢子宽度的 1/2 即为萌发），计算各菌株的 EC50 值和抗药性指数。具体步骤按照 NY/T 1156.12006。LAMP高通量测定法本方法适用于监测因小麦赤霉病菌2-Tubulin的F167Y基因型突变引起的多菌灵抗性。根据LAMP 扩增产物的颜色可判定菌株是否为多菌灵抗性，具体技术方法按照附录A执行。抗药性评价抗药性频率及

7、风险评价抗药性频率（%）=抗药性菌株数/测定菌株数100。抗药性频率 5%以下，为低等风险；抗药性频率为 5%10%为中等风险；抗药性频率 10%以上为高等风险。影响抗药性风险的其他因素抗药性指数抗药性指数 520，为低等抗性水平；抗药性指数为 20100 为中等抗性水平；抗药性指数大于 100为高等抗性水平。抗药性群体的抗药性指数越大，抗性风险越大。交互抗性模式当测定到抗性菌株时，则进一步测定其对其他杀菌剂的交互抗性。具体按照 NY/1859.6 执行。若与其他药剂有交互抗性，则一定程度上加大了抗性风险。田间种植方式单一种植同一小麦品种，有利于抗药性群体的发展。田间气候条件合适的温度、湿度有

8、利于小麦赤霉病菌的生长、繁殖和侵染，同时也有利于抗药性群体的发展。结果应用由省农业主管部门发布小麦赤霉病菌抗药性监测结果，指导全省小麦赤霉病化学防控科学用药。抗性菌株及废弃样本的处理将抗性菌株 4保存于含有 PDA 培养基的冻存管中，以备复测。将分离后的样本烧毁或高温灭菌处理，防止抗药性菌株在检测地点扩散。附 录 A（规范性）LAMP 高通量检测小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性（2-Tubulin 第 167 位氨基酸突变（F167Y）DNA 模板制备用试剂盒将分离的小麦赤霉病菌菌丝体或将含有病原的小麦病粒、或稻桩的子囊壳加入含有 CTAB 提取液的离心管中，用组织研磨机震荡 30 s（28 次/s

9、），在 12000 rpm 离心 3 min，吸取上清加入冰冻异丙醇沉淀 DNA；12000rpm 离心 3min，弃上清；用 70%的乙醇漂洗 1 次，12000rpm 离心 3min，弃上清，风干后加无菌水溶解基因组 DNA，备用。检测引物F3: TTCCAGCTGACGCACTCTB3: ACAGAAGGTCTCGTCAGAGTFIP: TGCGATCGGGGAACTCCTCG-TGGTACCGGTTCCGGTATG BIP: AAACCGTTATGCCCTCGCCC-ACGAGCTGGTTCAGAGACAA反应体系与条件（10 L）Bst DNA 聚合酶（8U/L）0.3 L；10ThermoPol 1.0 L；MgCl2（25mM） 1.6 L；dNTP（10 mM） 1.0 L；FIP（40 M） 0.4 L；BIP（40 M）0.4 L；F3（10 M） 0.2 L；B3（10 M） 0.2 L；甜菜碱（8 M） 1.2 L；HNB（2.5 mM） 0.6 L；基因组 DNA 0.5 L；dH2O（灭菌蒸馏水） 2.6 L。反应参数：63 60 min，8