2013年中销售会议滨说明文件中文版

1、Illumina SolexaSmall RNA Seq Protocol生物技术技术服务部2012 年 3 月目录第一章 连接 3接头和 5接头（Ligate 3and 5Adapters）3第二章 反转录以及扩增反应（Reverse Transcrible andlify）5第三章 cDNA 纯化（Purify cDNA Construct）7文库质检（QC the libraries）9第四章簇生成 (Cluster Generation)10第五章第六章上机（Sequencing）11第七章试剂和仪器（Reagent and Equipment）12地址：市科技园区路 151 号（20

2、1203）：021513202882 / 12第一章 连接3接头和5接头（Ligate 3and 5Adapters）1.实验前注意事项A、 在操作 RNA 的时候，要佩戴手套， RNase-Free 的。使用的枪头必需是B、 处理 RNA 所需的水以及试剂都是 RNase-free 的。C、 最后沉淀所需要的 100%EtOH 是在-20C 冰箱。而 70% EtOH是在室温。D、 在跑胶点样的时候避免样品间以及 ladder 的交叉污染。E、 起始材料选用 1g 经过 mirVana miRNA Isolation Kit（Ca#t.AM1560 AustX,US）抽提的 total RN

3、A。在 1.5 ml RNase-free EP 管中加入 1g Total RNA。取出一新的 200L PCR 管中加入如下试剂：2.3.ReagentVolume(L)Total RNARNA 3Adapter（RA3） Total volume516将以上混合物混匀，离心，在 PCR 仪上反应，（70C，2min）。取出一新的 200L PCR 管，加入如下试剂：3接头反应 Mix4.ReagentVolume(L)Ligation Buffer （HML）2地址：市科技园区路 151 号（201203）：021513202883 / 12RNase Inhibitor114T4RNA

4、 Ligation2，truncatedTotal volume5.将以上混合物混匀，离心，将配好的 3接头反应 Mix 4L 加到已变性的第 3 步 PCR 管中，混匀，微离心。6.7.在 PCR 仪上反应，程序为 28C1 hour。保持 PCR 管在 PCR 仪上，加入 1L Stop Solution （STP），用移液器吹打 6-8 次，在 PCR 仪上进行如下反应程序：28C反应结束之后立即放回冰上。15min。8.9.10.提前准备另一台 PCR 仪 70C，2min。将已经溶解的 5Adapter 在 70C，2min 的条件下变性，反应结束之后立即放回冰上。11.取出一新的

5、200L PCR 管加入如下试剂：5连接反应 MixReagentVolume(L)10mM ATPT4 RNA ligase 5Adapter（RA5）Total volume111312.将以上配制好的 5连接反应 Mix3L 加入到第 7 步已连接 3Adapter的 RNA 中。用移液器吹打 6-8 次，离心。13.14.在 PCR 仪上反应，程序为：28C待反应之后立即放回冰上。1 hour。地址：市科技园区路 151 号（201203）：021513202884 / 12第二章 反转录以及扩增反应（Reverse Transcrible andlify）1.在新的 200L PCR

6、 管中加入如下试剂：12.5 mM dNTP MixReagentVolume(L)25mM dNTPUltra Pure Water Total volume0.50.512.混匀，离心。放在冰上备用。3.取出新的 200L PCR 管中加入如下试剂：ReagentVolume(L)5and 3Adapter RNA RNA RT Prime （RTP）Total volume6174.混匀，离心,在 PCR 仪上反应（70C，2min） 变性。反应结束之后，立即放在冰上。5.取出新的 200L PCR 管中加入如下试剂：一链反应 MixReagentVolume(L)5XStrand Bu

7、ffer20.511112.5mM dNTP mix 100mM DTTRNase Inhibitor SuperScripII TranscriptaseTotal volumeReverse5.5地址：市科技园区路 151 号（201203）：021513202885 / 126.充分混匀，离心。7.加入 5.5L 上述反应混合液到第 4 步反应管中，混匀，离心，总的体系是12.5L。8.在 PCR 仪上反应。程序为：50C，1 hour。9.待反应结束后，立即放在冰上。10.取出新的 200L PCR 管中加入如下试剂：Paster MixReagentVolume(L)Ultra Pu

8、re Water8.5Pix（PML）25RNA PCR Prime 1（RP1）2RNA PCR Prime Index（RPIX）2Total volume37.511.混匀，离心。12.加入 37.5L Paster Mix 到第 9 步中，总的体系是 50L13.在 PCR 仪上进行扩增：a98C30sb11 cycles98C10s60C30s72C15sc72C10mindHold 4C地址：市科技园区路 151 号（201203）：021513202886 / 12第三章 cDNA 纯化（Purify cDNA Construct）1.取出新的 200L PCR 管中加入如下试剂

9、：ReagentVolume(L)1XPelletCo-PrecipitantPaNF0.2Ultra Pure Water1.8Total volume22.充分混匀，离心，标记为 0.1 X Pellet Pa。3.确定 1 X TBE 所需要的量，将 5 X TBE 稀释成 1 X TBE 备用。4.准备跑胶的电泳槽。5.将2L 的Custom Ladder 和2L 的DNA Loading Dye 充分混合，离心。6.将1L 的High Resolution Ladder 和1L DNA Loading Dye 充分混合，离心。7.在 cDNA 扩增产物中加入 10L DNA Load

10、ing Dye 充分混合，离心。8.准备 6% Novex TBE PAGE Gel，将样品和 ladder 点入上样。9.跑电泳条件为：180V45min 左右。10.准备 1SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain 染色。11.电泳结束之后，将含有扩增产物的凝胶放入染色盒中进行染胶 10min。12.用 21-gauge 的针将无菌、去核酸酶的 0.5 ml 离心管的底部钻孔，如下图所示。地址：市科技园区路 151 号（201203）：021513202887 / 1213.将钻有孔的 0.5 ml 离心管置于一个无菌、圆底、去核酸酶的 2 ml 离心管中，如下图所

11、示14.完毕之后，在 UV 透照仪下进行片段选择。15.用干净术刀进行切割。切出 147-157 nt 的片段。16.将切取的胶放到第 13 步准备好的离心管中，室温离心 14000 rpm2min。17.待碎胶离心到 2ml 的 EP 管中，加入 300L 的Ultra-Pure Water 到碎胶中。在旋转仪上旋转进行溶胶反应，常温 2 hours 或者过夜。18.反应完成后，将胶转至 5m 的过滤管中，600 xg 离心 10s，将胶和含 cDNA样品溶液分离。19.在样品溶液中加入 2L 糖原， 30L 3 M NaOAc， 2L 0.1x PelletPa(optional)和 97

12、5L 的-20C 预冷的无水乙醇。20.如需加强沉淀效果可放在-80C 30min 或者过夜。21.立刻进行 14000 rpm 4C 离心 20min。22.去上清，保留 DNA 沉淀。23.加 500L 的 70%乙醇进行洗涤。24.室温离心 14000 rpm 2min。25.去上清，保留 DNA 沉淀，打开盖子 37C 金属浴进行干燥 5-10 分钟，确保完全干燥。26.加入 10L 10mM Tris-HCl，PH 8.5 缓冲液溶解 DNA 沉淀。地址：市科技园区路 151 号（201203）：021513202888 / 12第四章 文库质检（QC the libraries）1

13、.使用Qubit 2.0 Fluorometer 仪器，应用Qubit dsDNA HS试剂盒检测文库浓度。2.使用Ag纯度。nt 2100系统，High Sensitivity DNA Chip检测文库的大小和地址：市科技园区路 151 号（201203）：021513202889 / 12第五章 簇生成(Cluster Generation)1.模板 DNA 准备：用含有 0.1% T DNA 到 2nM。配制 Mix 如下表：n 20 的 10mM Tris-Cl,PH 8.5 调节模板2.ReagentVolume(L)2 nM template DNA100.1 N NaOH10To

14、tal volume203.4.5.6.7.混匀，280 xg 离心 1 分钟。室温放置 5 分钟使模板 DNA 变性。转移 20L 变性模板到 980L 预冷的 HT1 中，配制成 20pM 模板，冰上放置。用预冷的 HT1 稀释步骤 5 中的变性模板到所需浓度，混匀，离心。分别吸取 120L 不同模板到 PCR 排管中，记下每个模板对应的位置，冰上放置备用。每次运行簇生成仪器 cBot 前，按照仪器说明运行 pre-run wash 程序。8.9.仪器后在 cBot 界面上输入样品信息并从程序列表中选取 SRcluster generation 程序。扫描 cBot 试剂板 ID，随后放入

15、仪器中对应位置。扫描 Flow Cell ID，随后放入仪器中对应位置。 将 manifold 放到 Flow Cell 上并固定好。在 cBot 界面上输入模板 ID，并将步骤 7 中准备好的模板放到 cBot 中对应的位置。将含有引物的 PCR 排管放到 cBot 中对应的位置。10.11.12.13.14.15.运行 Pre-run check 程序，成功完成后点击 Start按钮开始 clustergeneration。16. 成功完成 cluster generation 后，仪器。地址：市科技园区路 151 号（201203）：0215132028810 / 12第六章 上机（Se

16、quencing）1. 准备多重试剂：HP3，HT2，HP8，PW1。2.recipe 选择：ver8 multiplexed single-read sequencing recipe。3. Paired-End Module：按照仪操作要求进行仪器。4.5.6.将多重试剂按照在仪中放好。安装 Flow Cell。进行第一个碱基并核对 Quality Metrics：Goodness of fit: 0.9900，Sensitivity: 350400。查看第一个碱基7.：包含 cluster counts,ensityvalues,focusmetrics, focus继续进行 read

17、1ition, and flow cell tilt。8.9. read 1结束后自动进行 index。10.运行结束后，仪器。地址：市科技园区路 151 号（201203）：0215132028811 / 12第七章 试剂和仪器（Reagent and Equipment）试剂仪器1.2.3.4.5.6.7.8.MicroCentrifuge, Eppendorf, 5418Centrifuge, Thermal Scientific Multifuge X3RHeat block , 杭州博日科技HB-100dbiosystems, 9700, # 11GeneScalpel: PCR S

18、ystem, App仓松医疗器械Heat block, Eppendorf ThermalSPlusQubit 2.0 Fluorometer, Invitrogen, Q32866Agilent Technogies 2100Bioyzer，Agilent Technogie地址：市科技园区路 151 号（201203）：0215132028812 / 12DescriptionCompany and Part No.TruSeq Small RNA Sle prep CoreSolutions BoxIllumina，15016911TruSeq Small RNA Sle prepIndiA BoxIllumina，15016912TruSeq Small RNA Sle prepIndiB BoxIllumina，15016914TruSeq Small RNA Sle prepIndiC BoxIllumina，15016916TruSeq Small RNA Sle prepIndiD BoxIllumina，15016918SuperScript II Reverse Transcriptase with 100mM DTT and 5XStr