中国大豆广适品种SMV抗性的时空演变分析及CRISPRCas9介导的抗性基因编辑

1、中国大豆广适品种SMVt性的时空演变分析及 CRISPR/Cas阶导 的抗性基因编辑大豆 Glycine max(L.)Merr. 起源于中国 , 是人类植物性蛋白和食用油的主要来源 , 在我国国民膳食体系中扮演着重要角色。 大豆花叶病毒 (Soybean mosaic virus,SMV) 引致的病毒病是一种全球性病害, 造成大豆大幅减产和品质恶化。目前，尚无有效的化学药物能够防治SMV鉴定抗性资源、培育抗病品种是防 治SMV1经济、有效、安全的手段。我国是大豆起源国，拥有丰富的品种资源， 对我国大豆种质特别是广适大豆品种进行SMVK性评价,明确大豆主产区SMM性时空演变趋势，进而筛选优良抗

2、病种质资源,对SMM病育种具有重要意义。此外 , 转基因技术可以打破物种间的屏障, 在较短时期内完成优良抗性基因的定向改造、 重组和转移 , 大幅度缩短抗病育种进程。 近年来兴起的 CRISPR/Cas9 基因组定点编辑技术，为作物育种提供了新的方法策略，有望培育出对SMM有 广谱、持久抗性的转基因大豆新材料。本研究选取97个在中国大豆主产区大面积种植的大豆品种，进行SMVS性鉴 定。上述品种来源于黑龙江北部地区(NH)、黑龙江中南部地区(MSH吉林辽宁 地区 (JL) 、黄淮海流域(HH), 育成年份在1923至 2006年间。分别接种SC3 SCZ SC8 SC11 SC15和SC18等S

3、MV亍株系。结果表明，6种SMVt系的平均病情指数(ADI)变化范围为26.95-48.97。对不同SMVft系而言，抗病品种的数量(比例)变化范围为27(27.8%)至64个 (66.0%), 感病品种的数量(比例 )变化范围为 33(34.0%)至 70个(72.2%) 。来自 NH、MSH儿和HHM区大豆品种对6种SMVft系的平均病情指数分别为 50.82(变化 范围为 32.31-59.31) 、 47.27( 变化范围为 22.52-59.35) 、 43.10( 变化范围为28.97-51.71) 和 33.05( 变化范围为 25.05-41.7) 。对于NH和JL地区来说,6

4、种SMVt系的病情指数随着品种育成年代的推进 呈现出整体下降趋势。反观 MSHfe区，所有SMV*系的病情指数均随品种育成年 份推后表现出不同程度的上升趋势。在HHH区,SC15株系的病情指数呈现明显下降趋势，SC3和SC18ft系的病情 指数呈现明显上升趋势。对 SMVK性的时空演变分析表明：NH和JL大豆产区应 继续保持并不断提高现有的SMVK病育种水平；MSH*豆产区应加强所有SMVft 系的抗病育种工作；HH大豆产区应特别针对SMVft系SC3和SC18进行抗病育种 工作。本研究共计筛选出24个具有广谱抗性的大豆品种，这些品种对6种SM维系 的平均病情指数在0.80 至 35.52 之

5、间 ; 共计筛选出 13个具有极端抗性的大豆品种，分别有5个和8个品种来自JL和HH*：豆主产区，均至少高抗1种SMVt系。对国内外13个SMVy亍株系的全基因组序列进行多重核甘酸序列同源性比对 ， 确定出SMV HC-Pro#因正义链ss(+)RNA的保守区间为核甘酸位点 2039-2309 nt; 负义链 ss(-)RNA 的保守区间为核苷酸位点 8448-8467 nt 。在此基础上，分别搜索其PAM&点，并确定出相似度为100%勺gRNA(+)/gRNA(-)靶点序列。通过同源重组反(?)应，分分别就SMVHC-Pro基因正 义链和负义链构建了 CRISPR/Cas9S因组编辑载体，最

6、终将将鉴定正确的重组载 体通过冻融法导入农杆菌菌株 EHA105。利用农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系，以SMV8病大豆品种Jack为受 体材料 , 以萌发 24 h 的成熟大豆子叶节为外植体, 以如 r 基因作为筛选标记进行 大豆转基因实验。通过种子萌发、外植体制备、农杆菌侵染液制备、侵染、共培养、丛生芽诱导、芽伸长、生根、炼苗、驯化、移栽等组织培养过程, 共计获得 抗性组培苗 319 株。采用除草剂涂抹（200mg/1 Basta）、PCR（gRNA办Mr）和PAT/kr转基因检测 试纸进行鉴定，共筛选出阳性TO代大豆植株83株。对来自于31个To家系的796 个乃代单株进行除草剂涂抹鉴

7、定, 共获得 1 阳性植株 493 株 , 之后通过 SMV（SC3株系）抗病鉴定、实时荧光定量qRT-PCRffi DAS-ELISA血清学实验，分别从表型水 平、RNAK平和蛋白水平对阳性乃代大豆植株进行检测分析。抗病鉴定结果表明，SMV（SC琳系）抗性在1代植株中得到一定程度的提升， 其中高抗植株（HR）15株（占3.0%）、抗病植株（R）53株（占10.8%）、轻微抗病植株 （MR）58株（占 11.8%）、感病植株（S）367 株（占 74.4%）。在接种 SMVf 15 d 和 30 d的两个时间点进行qRT-PC骸验,结果表明，随着转化植株抗性水平的降低 （HR/R/MR/S）,

8、叹他和办CtwP基因的表达量水平不断下降，SMVW毒积累量（SMVCP 基因）不断上升,SMV病毒积累量与；基因的表达量水平呈负相关，说明办基因的 转录本对SMVS到了抑制作用，抑制效果与该两个基因的表达量水平密切相关。接种SMV3月后,对转化植株进行DAS-ELISA析，结果表明，高抗植株（HR） 的数值均低于2.0（SMV阴性），随着转化植株抗性水平的降低（HR/R/MR7S）,数值 不断增加，均高于2.0（SMV阳性）。此外,还对T2种子的种皮斑驳现象进行了调查， 发现随着转化植株抗性水平的降低（HR/R/MR/S）, 后代褐斑粒数量不断增加, 籽粒褐斑面积不断扩大，平均褐斑率逐步上升；HR植株后代籽粒的种皮斑驳现象被彻 底消除 , 与阴性对照无异; 阳性对照、R、 MR、 s 类型转化植株后代籽粒的褐斑面