发酵工业的无菌技术

1、第四章 发酵工业的无菌技术第一节 发酵工业污染的防治第二节 发酵培养基及设备管道灭菌第三节 空气除菌纯种培养要求必须防止杂菌污染为防止染菌，采取了一系列措施： 密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、无菌操作；染菌无法彻底避免；据报道： 国外抗生素发酵染菌率为25%，国内抗生素发酵、青霉素发酵的染菌率为2，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为5%，谷氨酸噬菌体感染率为12。染菌影响产率、质量、三废治理都有很大的影响。第一节 发酵工业污染的防治一、污染的危害1、染菌的不良后果 消耗营养合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难改变pH分解产物噬菌体破坏极大2.染菌危害的具体分析（1）染菌对

2、不同菌种发酵的影响A细菌谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。B. 霉菌PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无所获。柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 。D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。（2）染菌种类对发酵的影响青霉素：怕染细短产气杆菌链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌柠檬酸：怕染青霉菌肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连

3、续污染（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响种子扩大时期染菌:灭菌后弃去。发酵前期染菌：应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种。发酵中期染菌：危害极大、挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定。 抗生素发酵 ：输入正常发酵已产抗生素的发酵液。柠檬酸发酵： a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细菌 。 b. 污染酵母：加入0.0250.035g/L CuSO4抑制酵母；通风加大，加速产酸。c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。发酵后期污染染菌量不太多，可继续发酵。污染严

4、重，则提前放罐。杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价。（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难。 处理方法：将发酵液加热后再加助滤剂；先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化。二、杂菌污染的防治1、染菌的检查与类型判断(1)显微镜检查法：菌体(2)平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑(3)肉汤培养检查法 （酚红变色pH6.8-8.4） 以上方法缺点：镜检出杂菌需要

5、一定时间。(4)发酵过程的异常现象判断DO2水平异常变化：pH异常变化： 污染产酸菌或者利用碳源效率高生长较快的杂菌尾气CO2异常变化： 染菌引起糖的消耗变化，染好氧性杂菌，糖耗加快， CO2含量增加；染噬菌体，糖耗减慢， CO2含量减少。12污染噬菌体后异常现象2. 污染原因分析 主要原因： 种子带菌 无菌空气带菌 设备渗漏 灭菌不彻底 操作失误 技术管理不善(1)从杂菌种类看：耐热芽孢杆菌：与灭菌不彻底有关。球菌、无芽孢杆菌：与种子带菌、 无菌空气带菌、 设备渗漏、操作失误有关。浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏霉菌：与操作失误、 技术管理不善有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题。酵

6、母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长。 (2)从污染时间看：早期污染可能与种子带菌、无菌空气带菌、灭菌不彻底 、操作失误 有关。后期污染可能与设备渗漏、操作失误及中间补料有关。(3)从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题。个别罐连续染菌，一般是设备问题。3、杂菌污染的途径及其预防(1)种子带菌的防治 灭菌彻底：培养基及用具灭菌要彻底，应防止假压。接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠。保藏可靠：(2)过滤空气带菌的防治提高空气进口的洁净度。除尽压缩空气中的油和水。保证空气过滤器介质的填装质量。 (3)设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治发酵罐的“

7、死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件。 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口。 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角” 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 法兰连接不当造成的“死角” 灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法设备渗漏引起的染菌及其防止发酵设备、管道、阀门长期使用，由于腐蚀、摩擦和振动等原因，造成渗漏。方法：选用优质的材料，并定期进行检查。微小渗漏的检查：加入碱性水，用浸湿酚酞 指示剂的白布擦，有渗漏则白布显红色

8、。(4)培养基与设备灭菌不彻底的防治原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 假压：实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂，防止泡沫升顶。连消不彻底 ：蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，最好采用自动控制装置 。灭菌后期罐压骤变：灭菌后，冷却水冷却时，如冷却过快造成罐内负压造成染菌。冷却前先通入无菌空气维持罐内一定的正压，再进行冷却 。 死角 ：消除。(5)操作不当造成染菌移种时或发酵过程中，罐内压力跌至零。管道阀门操作不当，无菌空气的压力突然下降，罐内压力高，发酵液倒流进入与发酵罐液面下相连的各个管道以及空气过滤器 。(6)噬菌体染菌及其防治以净化环境为中心的综合

9、防治法。 采取哪些措施能够保持无菌发酵？物料、培养基、中间补料要灭菌；发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；好气发酵通入的空气要除菌；种子无污染；接种无菌操作过关；为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。培养基灭菌的定义是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其芽孢或孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。灭菌与消毒的区别灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿表面的微生物。第二节 发酵培养基及设备管道灭菌1.化学试剂灭菌法 甲醛、乙醇或新

10、洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒2.射线灭菌法3.干热灭菌法 电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：无菌室、接种箱常用烘箱，灭菌条件：160下保温1h 适用范围：金属或玻璃器皿4.湿热灭菌法 利用饱和蒸汽灭菌，条件：121，30min 适用范围：生产设备及培养基灭菌5.过滤除菌法 利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气 6.火焰灭菌法 火焰 适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口 一、常用的灭菌方法 湿热灭菌的优点：蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有很大的潜热（冷凝热）；操作方便，易管理。培养基的湿热灭菌 热阻 定义：微生物对热

11、的抵抗力称为热阻，可用比死亡速率常数k来表示 。 k，热阻, t当温度T一定时，k随微生物不同而不同，具体计算时，可取细菌芽孢的k值为标准。当 T 变化时，k有很大变化，其变化遵从阿累尼乌斯定律 k=Aexp(- E/RT) k与微生物活化能及T有关 热阻 大肠杆菌在不同温度下的残留曲线嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线 影响培养基灭菌的其它因素 培养基成分油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH2

12、0 m)，且雾粒浓度较大，故适宜用旋风分离器分离。第二冷却器使空气进一步冷却后析出较小雾粒(1 m)，宜采用丝网分离器分离，这样发挥丝网能够分离较小直径的雾粒和分离效率高的作用。通常，第一级冷却到3035，第二级冷却到2025。除水后，空气的相对湿度仍是100，须用丝网分离器后的加热器将空气中的相对湿度降低至5060，以保证过滤器的正常运行。尤其适用于潮湿地区，其他地区可根据当地的情况，对流程中的设备作适当的增减。2. 冷热空气直接混合式空气除菌流程 压缩空气从储罐出来后分成两部分，一部分进入冷却器，冷却到较低温度，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理的高温压缩空气混合，此时混合空气已达到温

13、度为3035，相对湿度为5060的要求，在进入过滤器过滤。2. 冷热空气直接混合式空气除菌流程特点：省去第二冷却后的分离设备和空气再加热设备，流 程简单； 利用压缩空气来加热析水后的空气，冷却水用量少。适用于中等湿含量地区，但不适合空气湿含量高的地区。 采用高效率的前置过滤设备，利用压缩机的抽吸作用，使空气先经中、高效过滤后，再进入空气压缩机，降低了主过滤器的负荷，所得的空气无菌程度很高。3. 高效前置过滤空气除菌流程4. 利用热空气加热冷空气的流程利用压缩后的热空气和冷却后的冷空气进行热交换，使冷空气的温度升高，降低相对湿度。对热能的利用比较合理，热交换器可兼做贮气罐，但由于气气换热的传热系数很小，加热面积要足够大才能满足要求。提高过滤除菌效率的措施减少进口空气的含菌数量，主