临床科研方法课件ppt

1、临床科研基本方法学习篇一、提高心智生活水平（自我教育能力） 从哲学观点来说，所谓心智生活水平包括二个方面： 心灵生活“心灵愉悦”， 表示学习知识的乐趣心智生活 智力生活“智力快乐”， 表示运用智力的乐趣二、科研意识培养科研机遇平等，结果不同！善于对事物的细微观察好奇性 学问思辨行！三、培养强烈的创新意识民族生存的灵魂，国家兴旺的源泉！个人事业不断进取的关键四、培养创新科研意识 创新贯彻科研活动的始终 设计创新方法理论成果艺术包装营销方式、渠道管理体制 创新性是一切科研工作的生命，是科学发展的动力 临床科研的创新性、科学性与求异思维（一） 创新的本质 在人类物质文明、精神文明的一切领域，一切层面

2、上能先于他人，见人所未见，思人所未思，行人所未行，从而获得人类文明的新发展、新突破。 （二）创新的思想源泉 是求异思维，敏于生疑，敢于存疑 ，勇于质疑。由此就能不断地产生新异的、多彩的、多元的发展性、创新性、突破性的新构思、新思想、新思维。（三）科学的本质 是人类世世代代以每个人的有限认识能力，去探究无限的外界客观存在和客观规律的一个永无止境的过程。科学又总是后人不断发现前人认识中的缺陷、不足、错误，并予以修正、补充，乃至推翻其中某些错误结论而前进、而发展的。（四）科学精神的内涵包含五大要素：客观的依据理性的怀疑多元的思考平权的争论实践的检验 “疑”字是核心，是关键。 理性的怀疑，不疑不会有异

3、，无异不会有新。只有：生疑存疑质疑，才能有新发现，新发明。 求异思维从孩童期培养。五、科学精神，“疑”为核心客观依据理性怀疑多元思考平权争论 实践检验疑为核心敏于生疑敢于质疑勇于质疑娃娃抓起六、求异思维是创新源泉逆向思维异位反思自主思维排忧思维七、文化底蕴是生疑的物质基础 八、创新与继承的关系创新是最佳的继承继承为了更好的创新绪论篇 一、 医学研究的概念 疾病健康认识并掌握客观规律采取增进健康防治疾病的一切探索性措施防止促进研究目的完成具体工作方案最大效益本专业知识、相关专业知识流行病学、生物统计学、社会科学、分子生物学、免疫学等基本原理方法理论层次逻辑层次分析综合哲学层次归纳演绎感性认识理性

4、认识最小代价临床科研设计示意图经验层次二、科研设计循证医学与传统医学的比较基础（病理、生理）理论知识指导（个人）临床经验基础指导客观（实验）证据传统医学循证医学三、循证医学循证医学与传统医学的特征比较合格临床医生：临床经验与相关技能是必要条件，但非充分条件；累积经验，掌握疾病机理是必要的，但未经严谨设计研究的“临床经验和“理论”不能作为指导临床实践的充分依据；依据病理生理学原理进行诊断，有时可能有误；非系统临床经验是判断预后、疗效及评价的可靠途径；掌握发病机制和病理生理原理足以指导临床实践；循证医学传统医学循证医学与传统医学的特征比较掌握独立准确评价证据的方法，对正确认识和引用某些文献的研究结

5、论至关重要！成本效益是考虑诊疗的重要因素。熟练的技能与临床经验是指导实践的基础，可以评价新的诊疗方法；较少考虑成本效益与卫生经济学。循证医学传统医学四、临床流行病学定义 现代流行病学 卫生统计学 临床医学 设计 把 基本原理和方法引入 采用严密的 测量 医学经济学 研究领域 评价 医学社会学 结局 病因 患者个体 患者群体 诊断 医学事件的从 扩大到 藉以探索 治疗 等 诊治研究 特性研究 （研究） 预后 临床基础学科 预防五、 医学科研特点 人道主义问题应该前瞻性研究混杂因素多执行研究的人多依从性问题标准化的处理措施不易保证多中心多层次问题宜采用序贯实验方法（一）临床医学科研特点（二）基础医

6、学科研特点结构与功能假设的提出机理的验证结论的科学性（依据）结果的重复性设计的严密性操作的正确性样本的代表性（三）预防医学科研特点宏观为主宏观与微观相结合调查的代表性（抽样合理性）干预的客观性统计处理恰当结论的重复性方法的先进性科研设计篇前 言只有经过正规科研设计才能得出正确结论1.伤寒: 1880年由艾伯发现发现伤寒杆菌 ，16年后(1896年)开始广泛应用，但过了66年(1962年)，才由南斯拉夫伤寒全国委员会通过现场(实验)流行病学的研究方法，才作出适当评价。2.卡介苗: 1921年问世，30年后(1951年)经现场评价，才作出肯定结论。3.脊灰苗: 1909年发现病原体，45年后（19

7、54年）其疫苗问世，经现场评价，才作出肯定评价。4.百日咳: 1900年发现病原体(痰涂片)，用甲醛灭活制成疫苗，初期的研究结论互相矛盾，46年后(1946年)经大规模现场调查1万人，严格分组，最终证实其效果。5.英年早逝: 2006年，一位权威性的作者误报：中关村、北大、清华科研人员的平均年龄为53岁 (2004年全国普查的平均年龄为73岁)。一、科研设计的 一个基本原理 基本原理 必须尽量使实验效应(effect)是处理因素(treatment factor)所引起，即: T e二、临床科研设计的两个基本原则 (一) 两组间非处理因素均衡一致原则 用公式表示如下： 基本原则的公式表示T1+

8、N1 Te1+Ne1T2+N2 Te2+Ne2N1=N2 T1 T2 : 处理因素 Te1 Te2 : T产生的效应 N1 N2: 非处理应素 Ne1 Ne2 : N产生的效应例1 食管癌的病因研究(病例对照研究) 居住年限 病例组人数 对照组人数 合计 1025303540合计1117311960138123026195113823475738111276西安市食管癌病例与对照居住年限的均衡性检验 2=4.81，P0.05例2 新生儿黄疸是否与母亲临产时使用催产素有关？ 1972年1986年争论14年，6篇支持，6篇反对。台湾妇产科一位学者从1986年5月12月按下列标准从就诊病人中选取20

9、6例合格病例，进行各种条件严格控制的前瞻性研究。 -研究对象与研究方法1纳入标准与排除标准队列研究设计应规定明确的纳入与排除研究标准。纳入标准：孕妇健康、胎儿足月、经阴道生产，胎儿为单胎头位，新生儿出生后至少能在婴儿室观察5天。排除标准：有溶血性疾病与低体重婴儿。根据产妇的生产情况，206例分成三组: 组：60例，完全由催产素导产；实际为暴露 组，为暴露I组。 组：95例，自然生产加催产素催产；实际也是暴露组，为暴露II组。 组：51例，完全为自然产程，未用催产素，这为非暴露组。2分组3给药方式 静脉点滴给药，用含电解质的溶液溶解催产素，催产素浓度为5U/500ml。 -结果 三组研究对象的均

10、衡性 作者把三个组之间可能影响研究结果的主要变量作了比较，结果表明这些影响因素在三组之间无显著差异（P0.05） （表1）。 表1三组之间主要变量的比较 变量I组II组III组性别（男/女）婴儿体重（均数，g）孕期（周）母乳喂养（）Apgar记分（1min/5min）器械助产率（）硬膜外麻醉地美露AFP（ng/ml）28/323 22840.1608.9/9.62822126 34744/513 27040.9558.7/9.33523112 47825/263 28639.9668.8/9.53312109 2882.三组新生儿总血清胆红素水平（计量资料） 比较三组新生儿出生后第一、第三、第

11、五天的总血清胆红素，用检验处理，未见显著差异（P0.05）（表2）。 表2三组新生儿的血清总胆红素（10mg/dl，xS） 时间组组组第一天第二天第三天4.91.59.22.29.92.85.11.79.13.09.13.44.91.49.62.510.03.33. 三组新生儿高胆红血症比例的比较 （计数资料） 如果把1次或多次的血胆红素值10mg/dl作为高胆红素血症，则三组新生儿之间的高胆红血症的比例，用2检验无显著差异。如果把这个“界线”定为12mg/dl或15mg/dl，三组之间仍然没有统计学上的差异（P0.05）（表3） 。 表3三组新生儿高胆红血症的发生率 血清胆红素组（N60）

12、组（N95） 组（N50） 人数 % 人数 % 人数 % 1012153917364.028.0 3.35634359.036.0 3.22617352.034.0 6.0-结论由上述结果，作者认为如果生产过程中，使用的催产素量不多，输入的溶液又含有电解质，也即如上述研究中的给药方式，则新生儿高胆红血症与应用催产素无关。根据设计原则提出的四种设计模式T与N四种不同关系的临床设计方案T1 + N1 e1 + n1 T2 + N2 e2 + N2 (正 确)T与N四种不同关系的临床设计方案T1 + N1 e1 + n1 T2 + N2 e2 + N2(正 确)T与N四种不同关系的临床设计方案T1

13、+ N1 e1 + n1 T2 + N2 e2 + N2 T与N四种不同关系的临床设计方案T1 + N1 e1 + n1 T2 + N2 e2 + N2 (二)对照、随机、重复原则对照：是研究工作成败之关键；对照组、试验组必须保持均衡一致！可比性；是控制各种混杂因素的基本手段；正确的对照组可以平衡非处理因素对结果（e）的影响，使处理因素（T）的效应（e）充分表现出来，即Te。随机采用随机化原则来分组、干预，是使各组间非处理因素均衡一致的主要方法，也是实验数据统计处理的基础；可以减少各种主、客观因素造成的偏倚，减少系统误差，从而提高实验的准确性（即效度）；也是防止各种混杂因素的重要手段之一；随机

14、不等于随意。重复按对照组和试验组都必须要保证一定的样本含量，以控制随机误差，从而提高实验的精确度（即信度）。 （标准差）x (标准误) = N （样本量）三、临床科研设计的三要素 临床科研一般是观察或阐明某个或某些研究因素作用于研究对象而产生的效应或影响。因此，它的主要组成必然是: 研究因素 研究对象 三大要素 研究效应/影响（一） 研究因素 根据研究目的而施加于研究对象并能产生效果的因素为研究因素/处理因素。反之，与研究目的无关的其他因素都叫非处理因素（如个体特征，环境特征，气候特征等）。 1. 研究因素的内容： (1) 外界强加于研究因素的，如生物因素、理化因素、营养、药物。 (2) 研究

15、因素本身就具有的某些特征，如性别、年龄、体重。 (3) 研究对象体内环境产生的有害因素，如遗传、代谢、心理。 (4) 医生给予的干预因素。 2.研究因素的构成：单因素、多因素及不同水平 3. 研究因素的强度 4. 研究因素的实施方法(二) 研究对象研究对象：是指研究因素作用的客体。 选择研究对象是一个十分重要的问题（1）正常人，在研究某项正常人指标或评价预防措施的效果时常用（2）病人 1.确定诊断标准，尽量采用客观指标。如病理学、微生物学、免 预学、X线、心电图、内窥镜、断层扫描等 2.多次核实诊断 3.规定对象的纳入和排除标准 4.确定对象的数量、分组的方法 5.对象的代表性 6.注意对象的

16、病情，坚持采用轻症患者的标准 7.用志愿者要慎重例1： “血管内皮功能障碍对胰岛细胞分泌功能的影响 ” 研究对象: 纳入条件 年龄：3555岁 无高血压和糖尿病史 无心、肝、肾及其他疾病 排除条件 高血糖 II型糖尿病史 糖耐量减低 / 空腹血糖正常 肥胖：按WHO1998年诊断标准： 体重指数（BMI）正常 25BMI 1年 偶然吸烟平均 1年 戒烟停止吸烟 1年 (三) 效应和观察指标效应：是指研究因素作用于研究对象产生的结果，及观察结果的指标。 1 选择指标的条件 (1) 指标的关联性 (2) 指标的客观性，如随机分组、采用多人盲法读X片等 (3) 指标的准确性（accuracy）、精确

17、性（precision）即重复性 (4) 指标的灵敏性（sensitivity） (5) 指标的特异性（specificity） (6) 指标数量适宜，主要采用能反映效应本质的指标 (7) 明确各项指标观察的统一要求，如观察方法、时间、间隔、次 数、期限、记录方法等四、临床科研设计模式（一）临床科研种类 1.观察性研究（observational studies) 2.试验性研究 (experimental studies)，即临床试验（clinical trials)。 3.多学科多中心研究（multiple-center studies）(二) 临床科研方法汇总（1）观察性研究设计 病例报

18、告 描述性研究 病例分析 （临床研究初级阶段） 经验总结 观察性研 横断面研究 究设计 病例对照研究 分析性研究 （临床研究深入阶段） 队列研究 病例与对照不匹配 成组匹配病例对照研究 病例与对照匹配 配对研究 套式病例对照研究 前瞻性 历史性 双向性队列研究 过去 现在 将来收集队列 随访 收集队列 随访 回顾性 前瞻性 双向性队列研究 （2）试验性研究设计 临床研究的试验性研究即临床试验，实际上可以把它看成是一种特殊类型的队列研究。所不同的是研究者可以设计对照组和治疗组并随机化分组。 依据设计对照组的方法不同，临床试验设计方案可分为六种 随机对照实验（RCT） 符合标准的研究 对象 研究对

19、象 随机分组 （合格对象） 有效 试验组(实验措施） 无效 有效 对照组(对照措施） 无效 随机对照双盲试验（RCBT） 交叉试验（COD） 试验组 实验 有效 （A组） 措施 无效研究 合格 随机 对象 对象 分组 对照组 对照 有效 （B组） 措施 无效 对照组 对照 有效 （A组） 措施 无效 试验组 试验 有效 （B组） 措施 无效洗脱期 自身前后对照试验 有效 研究 合格 试验 对象 对象 措施 无效 有效 对照措施 无效洗脱 期 非随机同期对照试验（NRCCS）和历史对照试验 这两个试验的共同点是：对照组并非由随机化方法决定，而是依据不同的地点、不同的时间来选择。前者是指在不同医院

20、间选择，后者是指不同时期的前后对照。这些对照组的选择常存在选择性偏倚，两组间的基线状况往往不一致，从而影响结果的正确性，所以应用受到限制。 序贯试验不事先确定样本含量；一个试验一对受试者参加；实验结束立即进行结果分析；待可下结论时立即停止试验。 序贯试验示意图 y 接受冠心宁 拒绝冠心宁 0 n（三）多学科或多中心协作研究1. 多学科研究是提高研究水平的有效方法，也是现代研究发展方向。2.多中心研究是指在不同地区、不同单位，同时开展某一项研究，以提高研究结果 的论证强度 。 注意：上述两种研究方式必须事先要严格统一研究的各项规定、方法、指标、要求、时间等，否则，将失去意义。 南方医科大学研究生

21、开题论证报告书学科专业：研究方向：课题名称：课题来源：研究生姓名：导师姓名职务：研究时间：论证日期： 一、课题名称（包括分题）二、选题依据（国内外研究概况、水平和发 展趋势，开展此课题研究的设想、特色或创新之处，主要参考文献目录和出处。 三、研究目的意义四、研究内容指标、技术路线及拟采取的研究方法（论述方法学的先进性、可能性及可靠性）五、主要技术关键及解决途径（包括协作要求）六、研究进度及预期达到的指标七、课题研究的支撑条件（具备的研究条件、估算该题的工作量及所需经费）八、参加论证人员（姓名、职务、工作单位）九、专家论证意见（对该课题的科学性、先进性及可行性进行评价，提出“同意开题或不同意开题

22、”的结论性意见）国家自然基金申请书T2DM易感基因PPARGC1分子机制及遗传与环境交互作用的研究报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）1、项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录） 研究意义 T2DM是一种由遗传因素与环境因素联合作用而导致机体以慢性高血糖为特征的一类增龄性、内分泌、代谢异常综合症，为胰岛素 分泌不足或胰岛素抵抗或两者兼有所致。是最常见的一类慢性代谢性疾病，严重威胁现代人类的生活质量，据WHO资料统计T2DM患者 近500

23、0万人，高居世界第二位，仅次于美国。按此计算，我国因T2DM所造成的直接经济损失和医疗负担十分惊人。以上提示其对我国人民健康影响日趋严重。因此，预防和控制糖尿病已乘务当今预防医学领域重要课题。然而迄今为止，糖尿病的确病因尚未充分阐明，其遗传病因学十分复杂。为此开展我国的T2DM发生的分子机制，寻找致病易感基因。将为进一步开展功能基因研究，从基因角度及阐明2型糖尿病的发病机制和2型糖尿病的分子诊断，为基因预测提供科学依据和理论基础；从遗传与环境的交互作用的关系出发，探索其致病因素作用；无疑对阐明其病因及其发病机理，以至有效预防、控制、干预和治疗糖尿病的发生发展都具有重要的意义。学术价值： 近年，

24、随着分子生物学理论及技术的发展，尤其是人类基因组计划研究迅速进展和突破、基因定位技术经验的积累及统计分析方法的进步，使得2型糖尿病的分子遗传学研究有了长足进展。阐明参与2型糖尿病的易感基因种类、特征及机制是2型糖尿病分子遗传学研究的目标之一。目前比较常用的是采用候选基因的功能区或非功能区多态标记进行群体关联分析，或是采用随机DNA位点或候选基因的高杂合度非功能区多态标记进行家系分析。2型糖尿病受到遗传基因与环境条件的双重调控。不同遗传背景的人群糖尿病易感性的主效基因可能有较大的差异。以往在不同群体进行易感基因的关联研究发现，同一易感基因在不同群体中作用具有差异性。所以对于在其他人群所发现的易感

25、 基因，在中国北方人中重新评价就显得非常必要，探讨易感基因的分子机制在T2DM发病中的作用及其影响更有其特定的价值。研究遗传与环境因素的交互作用，可以进一步探讨其致病的作用因素，为寻找致病线索提供依据。国内外研究现状及发展动态分析 国内外研究证实人们采取基因组扫描、连锁分析和遗传关联的研究策略，筛查研究出的T2DM候选基因大约有500多个，其中有一些多态性可能与糖尿病的发生有关。我国对T2DM已进行近20个候选基因研究，发现至少10多个基因与T2DM有关联。从国内外已发表的T2DM连锁位点分布可看出：与T2DM可能连锁的染色体位点分布非常广泛。只找到位点，绝大多数位点尚未找到与T2DM相关的具

26、体基因。位点不同人群、种族和国家重复性差。由此可见寻找中国人T2DM易感基因并探讨其分子机制尤为重要。 由于遗传异质性的存在，不同群体中分子遗传学的研究结果很难得到重复。肝细胞中特异表达的过氧化物酶体增殖物的激活受体辅激活因子1（PPARGC1），在T2DM胰岛素抵抗（IR）发生机制中起关键作用，作为转录辅激活因子，由于其参与糖代谢、脂代谢、线粒体能量代谢的调节，与T2DM的病理机制十分吻合。在T2DM患者中，其表达量的异常改变具有特征性的病理学意义，从分子生理角度上提示其是研究T2DM的机制和应用治疗的极好的切入靶点，被密切关注。为阐明PPARGC1在中国北方人群中与T2DM的风险贡献，本研

27、究采用基因组遗传学研究方法对PPARGC1与T2DM分子遗传机制进行初步探索。由于基因组DNA序列在出生后几乎不改变，使得阐明的DNA突变可以通过人群资料的分析说明其与疾病的关系。绝大多数T2DM为散发型，对于复杂的多基因疾病，从散发群体样本出发，通过T2DM遗传学研究中使用最广泛的“病例-对照”研究寻找中国北方汉族人群中T2DM的易感基因成为可行性措施。 近年来，PPARGC1中基因突变与T2DM的关系，在丹麦、日本、法国高加索人群、Pima印度安人、英国、奥地利、德国和荷兰人群中进行了研究。虽然由于遗传背景的差异，不同群体中得到的结果不完全一致，但多群体中PPARGC1与T2DM的发生整体

28、上存在关联，丹麦人群中使用聚合酶链反应-单链扩增多态性（PCR-SSCP）方法结合测序验证，发现了七个突变位点：Ser74Leu，IVS2+52CA，Asp475Asp，Gly482Ser，Thr528Thr，Thr612Met。其中Gly482Ser与T2DM有关联。（Ek J,AndersonGetal,2001）日本人群中，通过PPARGC1基因扫描SNP后发现三个多态性位点：IVS4-11TC，Thr394Thr和Gly482Ser。Gly482Ser与T2DM有关联以及The394Thr-Gly482Ser单体型与T2DM有关联。（Hara K, Tobe K, Okada T et

29、 al,2002）,在Pima印度安人群中也证明了Gly482Ser突变与T2DM存在关联。继丹麦、日本及Pima印度安人后，本研究对此基因与中国北方人群的T2DM发病关系也进行初步探索，并发现PPARGC1的Gly482Ser突变能显著增加中国北方人群的T2DM发病风险，在男性中此趋势更为显著。由于此基因全面系统研究较少，基于前期遗传学工作基础，确证研究包括其突变基因对功能的影响和连接启动子调控区序列变异对表达的影响，从两个方面探讨PPARGC1与T2DM中胰岛素抵抗关系的研究仍为空白。T2DM既受遗传因素的影响同时受环境因素的制约，传统研究交互作用应用的方法是病例对照研究，但应用病例对照研

30、究进行基因环境交合作用的研究需要很大的样本量，同时一些潜在的因素可能会对研究结果有较大的影响。 近几年来，研究者提出，可以用其他的研究方法进行基因环境交互作用的研究，例如无对照病例研究（case-only）,病例亲本研究（case-parental study）等。它对于交合效应的估计要比传统病例对照研究更精确，而且将有更大的把握度检验交互作用的存在。同时，采用无对照病例研究探索基因与环境交互作用，可以使研究的样本量也成本显著降低，另外，可以避免由于采用对照可能引入的各种偏倚。无对照病例研究也存在其自身的不足，首先，无对照病例研究是基于交互作用的RR乘法模型的，它只能对交互作用是否偏离RR值乘

31、法模型进行检验。其次，无对照病例研究假设遗传与环境之间相互 独立，研究者也常常将这种假设作为默认前提。但在有些情况下，这个假设不能成立。另外，从其统计分析的过程可以看出，无对照病例研究只能检验基因与环境交互作用是否存在，并估计其交互效应 的大小。因为没有对照，无法估计遗传和环境因素的主效应。 遗传因素在2型糖尿病（T2DM）的发生发展中起着重要作用。T2DM是一种 多基因病，其遗传模式有主效基因、微效基因和单基因等模式。寻找T2DM易感基因的策略主要有基因组扫描、连锁分析和遗传关联研究。近年来，应用这些遗传学分析方法人们发现了一些与T2DM易感性关联的染色体区域和基因，并取得了长足的进展，但对

32、于临床实践的要求仍然是杯水车薪，我们相信随着分子遗传学技术的发展和人类基因组计划的完成，人们必将找出更多的与T2DM密切关联的易感基因，为解释和阐明T2DM的遗传病理机制提供新的线索，指导糖尿病的预防和治疗。 虽然遗传流行病学的证据提示2型糖尿病的发生具有较强的遗传基础，但因在最近1020年内人类的遗传背景不会出现非常大的变化，糖尿病患病率的显著增高只能用环境因素的变化来 。目前，世界各国2型糖尿病患病率明显增高的主要因素为生活方式的变化（如热量摄入增加和体力活动减少）所导致的超重和肥胖；在病因学上，生活方式的改变对糖尿病患病率的影响可归结为环境因素的影响 在T2DM实际研究中，人们采用不同的

33、基因与环境交互作用分析方法进行研究。例如：病例对照研究，主要采用多因素Logistic回归的统计学方法、单纯病例研究、不完全病例对照研究、叉生分析法等。目前在实际研究中还存在一些问题，例如：基因易感性检测的替代方法还存在一定的局限性；还需要进一步加大估计交互作用的样本量。但是随着分子遗传学技术的不断发展，基因与环境的交互作用必将成为研究T2DM的好方法。群体遗传学统计分析方法，计算相应遗传信息量；进行多因素群体遗传学研究，了解T2DM基因与传递模式及在家族中遗传传递规律。以候选基因为标记，与传递模式及在家族中遗传传递规律。以候选基因为标记，2、项目研究内容、研究目标以及拟解决的关键科学问题（此

34、部分内容为重点阐述）项目的研究内容： 2型糖尿病（T2DM）发病率居世界第三位，属多基因复杂性疾病，其发病机理受环境因素与遗传因素的综合作用且具有高度异质性。为开展T2DM发病的分子机制研究，分离鉴定相关致病易感基因，进行T2DM遗传家系现场流行病学调查工作。在中国北方地区收集200个T2DM和IGT遗传家系、散发T2DM和IGT500人和健康500人份的血样和环境因素资料。进行家系遗传和表型信息收集及血生化指标测定工作，运用拟对有关联的编码基因标记按染色体分型，采用基因组改良扫描方法进行实验室分型。对无关联编码基因标记，选用相应数量的微卫星进行特定染色体扫描，寻找疾病候选位点。 同时利用PC

35、RRFLP分子生物学技术的实验方法验证已存在候选阳性基因PPARGC1的多态性。通过SAGE3.0等软件对基因分型结果做两点或多点的连锁、连锁不平衡分析及家系内基因传递与分离的TDT分析，以便确定染色体不同位点与疾病的相关性。为阐明T2DM病因及发病机理，指导临床预防和治疗提供重要依据。1、完成T2DM家系血样、家系遗传和表型信息的收集以及血生化指标测定工作。2、证实易感基因突变的临床意义的分子研究；case-control确定易感基因与疾病相关关系和风险数值；3、阐明2型糖尿病易感基因PPARGC1的分子机制及其对T2DM的影响；4、通过Logist回归及神经网络模型及叉生分析进行危险因素的

36、遗传与环境的交互作用分析，根据数据具体情况采用相对应的分析方法；研究目标： 5、通过群体关联分析和家系传递分析进行人群与T2DM遗传易感性的研究； 6、同时在家系研究方面进行有益的探索，从分子角度阐明2型糖尿病的发病机理，为2型糖尿病的基因预测提供科学依据。广泛应用于糖尿病的预防与治疗，在条件允许的情况下应用于临床诊断。 拟解决的关键科学问题： 1.进行本课题工作所面临的最主要的问题，就是采用什么样的策略进行易感基因筛查工作，国内外此领域的研究者经过多年经验，目前认为，对于多基因复杂性疾病，其最主要的易感基因研究策略不能单纯效仿单基因疾病或单表型形状决定基因的寻找模式。 2.T2DM发病过程中

37、，每个基因参与发病程度不等，大多数基因以微效基因模式参与其中，每个基因只是赋予个体某种程度的易感性，就每个易感基因而言均非发病所必须；而且，个基因可能通过各自不同的途径或发挥不同作用参与发病过程；最后，各基因致病效应之累积结合环境因子的作用构成个体的T2DM的易感性。3.由于其主要以散发的形式在群体中流行，并且本质的病因学起源各异，因此，基于经典家系资料样本利用分子标记进行连锁分析定位克隆的策略是不够妥当的。另外，由于大多数T2DM的发病年龄集中在中青年以后，并且有增龄性的发生趋势，由于人类的整体寿命的上限限制，多代患者间同时存在T2DM发生的几率很低。因此，从风险等位基因在多代间的传递规律上

38、分析基因的T2DM易感性，也是受到限制的，一般情况不只能进行到2代间分子标记的传递研究。4.“病例对照”研究是预防医学领域中流行病学的经典研究策略，不同于经典遗传学的理论，它研究的是在现实群体中，某种疾病相关的环境因素或遗传性内因的暴露和该疾病的人群分布状态，通过该策略，最终拟解决的问题，是该人群不同程度下暴露的环境因素或遗传性内因与疾病的关系，并且希望得到的是适合于指导本人群中绝大多数人进行疾病预防和早期干预的信息。 5.对于人群中现实存在的复杂多基因疾病的易感基因筛查，由于该疾病的特点，决定了预防医学学科和生物学学科的相互渗透和结合。应运而生地，基于随机群体中收集的T2DM患者和正常NGT

39、对照人群资料进行“病例对照”研究，是现代国际上寻找人群中的T2DM分子病因学因素的主流策略。同时考虑遗传与环境交互作用的影响。 6.目前研究认为，除了T2DM中的主效基因模式类型外，研究其易感基因时采用相关分析比连锁分析更有效，但由于连锁不平衡仅存在于染色体上极窄的区域内（在混合人群中，连锁不平衡的范围仅为2.5-10kb），因此要想通过基于连锁不平衡的相关分析进行基因组扫描，遗传标志的密度需要在5-20kb才能保证所有的易感基因均被检测到，这要求分布于整个基因组的极高密度的遗传标志，目前所认识的遗传标志中，只有单核苷酸多态性（SNP）符合这一要求。7.由于相关分析所需的样本量较大，因而整个扫

40、描工作的工作量将会非常巨大，这就要求遗传标志的检测功能自动化进行，SNP的检测手段正是朝着这一方向发展，因而极有可能成为未来研究糖尿病等多基因疾病相关基因的重要工具。8.SNP作为有效的研究工具，是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。在人群中的发生频率大于1%。SNPs包含了基因组已知多态性的80%-90%是最常见的遗传变异类型。遗传的选择压力导致SNP在单个基因及整个基因组中的分布是不均匀的，在基因编码区大约有200,000个SNPs，称cSNPs，与蛋白质功能有关，在非编码区的SNPs称ucSNPs。非编码区的SNP比编码区的SNP多。拟采取的研究方案： 1、本研究考

41、虑到T2DM属于多基因复杂性疾病，并且以散发为主的特征，以散发群体筛查为主导，小家系进行垂直验证为辅助参考，进行T2DM易感基因的关联筛查和验证工作。T2DM以候选基因为标记，采用基因组改良扫描方法进行实验室分型。 2、拟对有关联编码基因标记按染色体分型，可通过PCR-RFLP方法电泳定型在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳定型、银染、酶切，确定基因型。对无关联编码基因标记，选用相应数量的微卫星进行特定染色体的扫描，来寻找疾病候选位点。基因分型结果通过遗传学统计软件SAGE3.0、Genehunter2.0、Allegro等软件作两点或多点的连锁和连锁不平衡分析和家系内基因传递和分离的TDT分析，以便确

42、定染色体不同位点与疾病的相关性，并通过LOD分数高低定位某些排序有高概率的位点基因3、按DM的病因学，除需要精细定位，还需要有可靠的 群体case-control验证。所有拟定的候选易感基因，需要进行良好匹配，有足够数量的case-control验证和比较，进行Hardy-Weinberg平衡检测检查有否人群代表性。有良好的实验室质控，以保证实验稳定，数据可靠。采用传统的连锁和连锁不平衡分析方法进行遗传学统计分析。有完整父母信息的可用TDT方法进行分离分析传递不平衡检测。4、采用Logist回归及神经网络模型及叉生分析进行危险因素 的遗传与环境的交互作用分析。根据数据具体情况采用相对应的分析方

43、法。研究方法1、本研究中涉及的寻找疾病易感基因的策略人类基因组计划完成后，基因组DNA序列明确将简化识别疾病易感基因的步骤。候选克隆技术正成为复杂形状基因克隆的一种快捷高效的策略。目前研究糖尿病相关基因常用的技术是基因组扫描和连锁分析，连锁分析适用于分析基因型与表型有较密切关系，且疾病表型较单一的致病基因，而对于以多个微效基因为特征的T2DM易感基因的定位克隆不太适用。一般认为：研究T2DM等多遗传因素及环境因素参与的复杂性疾病时，采用基因群体的基因组SNP“case-control”关联分析，特别是基于连锁不平衡（linkage disequilibrium,LD）的关联分析比连锁分析更有效

44、。关联分析是基于群体中无亲缘关系的病例组和表现型正常的对照组在某个遗传标记位点上会出现不同的频率而设计的。通过两者频率的不同，就能推测所研究的 遗传标记和某个遗传病易感位点之间是否存在因果关系或连锁不平衡。 此领域内目前被更多数人接受的理论基础为“常见疾病-常见变异”假说（common disease,common variant,CDCV），该假说认为，T2DM等常见疾病的患病风险，主要由基因组常见变异积累造成，而非依赖于罕见的稀有基因组变异，后者在单基因疾病多多基因疾病中的主效基因模式中占主要地位。 常见疾病多由一种以上基因异常及致病环境因子呈正性或负性相互作用而引起。每个微效基因只赋予个

45、体某种程度的易感性，就每个易感基因而言均非发病所必需。因此，单纯依靠连锁分析的方法进行复杂性疾病易感基因的寻找和定位时，基于CDCV的理论假设其检验的效能相对偏低，其最终很难在群体中得到相对一致的结果。 1）连锁不平衡和单体型分析 连锁不平衡是指相邻基因座位上等位基因的非随机相关，也就是指：当不同位点的等位基因以单体型组合形式出现的几率高于随机分布而同时出现的几率时，那么称这两个位点处于连锁不平衡状态。用公式描述和衡量LD如下：假设相邻基因座位1和2，座位1的等位基因为M，m，其频率分别为PM，Pm；座位2的等位基因为N，n，其频率分别为PN，Pn；等位基因M和N在同一染色体上同时出现的理论频

46、率为PMPN，而实际出现的频率为PMN，那么，连锁不平衡的D值为PMN-PMPN。 LD的存在，可以归因为两种因素：一是由突变产生的多态性而形成，之后由于重组的发生，两位点间的LD程度逐渐减低；另一种是由于分子标记物理距离的靠近，由于发生重组的概率降低，而呈现出高LD的 表现。但值得注意的是，靠得很近的分子标记间并非总呈现出强的LD，相反，也有数据显示，对于距离较远的分子标记间也存在LD的状态。此外，一部分LD也可能由于遗传漂变和群体混杂而产生。LD的度量有多种不同的方法，大多数都应用于双等位基因的配对检验。目前常用的两种配对检验方法为连锁不平衡系数（coefficient of link a

47、ge diseruiligrium，D）和r2。它们的取值范围都是从0（连锁平衡）到1（完全连锁不平衡）。 分子标记间LD存在，是继续进行标记间单体型块（haplotype block）构建的前提条件。同一条染色体上的单体型结构，可被划分为一系列彼此分离的单体型块，其大小为3-92kb左右。这些单体型块被重组热点所分割，其内部重组率很低，处于高LD的状态。 基于此理论基础，如果单体型块的结构在基因组中普遍存在，那么基于群体的“病例-对照”关联研究所 需要的SNP数量将大为缩小，并且还能在后续的分析中，体现功能性等位基因效应的相互叠加，无论是作为非功能的分子标志，还是作为有功能的等位基因的组合，

48、其都具有更可持续推广的应用效力而被作为目前最常见的工具而得到广泛应用。 定义单体型块的方法很多，目前大多数学者更倾向于利用配对的连锁不平衡系数D以确定重组热点，因为测量重组似乎更符合单体型块的本质，并且，利用配对连锁不平衡系数D更合适于双等位基因。 2）连锁不平衡、传递不平衡（transmission disequilibrium test，TDT）和关联研究 将连锁不平衡应用于大规模的关联研究或针对特定染色体区段，甚至针对单基因的进行系统性SNP扫描分析，可用寻找和定位复杂性疾病的致病基因。连锁不平衡状态的存在，既可能提示继续进行单倍体块分析的可能性，本身也预示可能起基因组区域附近存在功能性

49、的突变位点。连锁不平衡分析和关联分析的结果是互通的。 传递不平衡检验是基于家系样本的另一种形式的关联研究。由于在群体关联研究的实验设计中，各环节都有可能影响数据分析的准确性，特别是研究群体的选择最为重要。基于散发群体的关联研究虽然有上述提到的策略优势，但是先证者效应、种族差异以及群体性别、年龄结构的差异，都可能出现所谓的“群体分层”，从而导致某基因位点与疾病存在相关的假阳性结果。传递不平衡不依赖于有群体分层可能的散发人群，而在相对背景一致的家系中进行研究。选择一个受累家庭内对照组。发现可以关联时，运用TDT需要测定患者及其父母标记物基因型。它是基于寻找假定的致疾病等位基因由杂合子父母传递给患病

50、子女的不平衡传递性，而推测致病 基因是否存在的方法。可以结合散发群体的研究结果进行回顾性传递规律验证研究。 在关联研究中，如果某一因素可增加某疾病的发生风险，而该因素在疾病人群中的频率高于正常人群，可认为该因素与疾病相关联。关联研究中，主要关注基于LD的间接关联分析，其基本原理为：如果某致病基因座与遗传标记（多态性的等位基因）存在强的LD关系，那么可以通过比较遗传标记在患者于正常个体间差异，最终得到该致病基因座在疾病发生中相对危险度。 3) 2型糖尿病的多为点单倍体遗传分析 单倍体型是倾向于共同遗传的一组紧密连锁的等位基因，可用于精细定位人类疾病基因。我们所有的染色体 均成对出现，一对染色体中

51、每条分别来自父母一方，上面的 基因及其排列顺序虽一致，但其序列并不相同。例如，每1000个核苷酸就存在一个单核苷酸多态性，因而区分来源于父母亲的变异体是可能的，称为父源或母源的等位基因。对父源或母源等位基因的区分使人类的疾病基因得以通过连锁分析定位到染色体某一位置上。在产生精子和卵子的生殖细胞中，父母源染色体配对并交换部分DNA片段，发生重组过程。重组之后，染色体称为福怒双亲等位基因的混合体。重组更多的发生在距离较远的DNA序列之间，因此，通过衡量疾病基因与已知位置序列之间的重组频率可以定位疾病基因。重组的另一结果是同一染色体上某些区段的序列倾向于共同遗传， 称为连锁不平衡的现象。这样一组极少

52、被重组打破的等位基因，构成单倍体型，在人类基因组中，单倍体型大小约为60000bp左右，可能包含的SNP位点约60个。单倍体型可被用于精细定位疾病等位基因，一个导致遗传疾病的新突破总是发生在一个群体已有的单倍体型之内，经过几代传递，重组事件可能发生在此单倍体型之内，但疾病等位基因仍然与最近的SNP组合在一起遗传，如果此单倍体型可以在一组病人中鉴定，在单倍体型内分型等位基因便可以使一个保守区域得以鉴定，此保守区域与致病基因指向同一染色体区段。由于SNP标记具有非常准确的定位致病基因的潜力，因而科学家有兴趣构建整个人类基因组单倍体图谱。 单倍体型分析对复杂遗传病的易感基因连锁分析具有重要作用，已成

53、为不可缺少的通过连锁分析精确定位致病基因的方法，在2型糖尿病等复杂遗传疾病的易感基因精细定位方面得到广发应用。 2 研究候选突变位点在家系中的垂直传递规律方法：使用的样本为采集T2DM病例对照样本的同时，同时收集的部分T2DM先证者的家系资料。家系入选的标准如下：1）入选的家系每个家系成员3人以上，包含1名T2DM的先证者在内至少有2个以上诊断明确的T2DM患者，如先证者与其一个同胞为T2DM患者，即为符合入选标准的家系。2）入选家系收集的信息和标本包含两代人以上，如先证者及其配偶与子女或先证者及其父母。家系结构类型如图1-1所示。电话约请先证者及其父、母、患者和未患者的同胞等其它家系成员，所

54、有受试者均签署知情同意书。于 空腹12小时后，次日早晨进行口服75克葡萄糖耐量试验（OGTT）分别测定0、30、60、120及180分钟血糖、胰岛素、空腹血糖。T2DM诊断标准依据WHO1999年标准。 3）共采集120个家系，先证者为候选突变Gly482Ser的突变杂合子的家系被二筛挑选出来，进行后续的家系传递研究，确定最终纳入的核心小家系。临床信息和血生化指标测定依据1999年WHO糖尿病专家委员会制订的糖尿病诊断及分型标准：1）有糖尿病症状，并且任意血糖11.1mmol/l。2）空腹血糖7.0 mmol/l。3）糖耐量试验餐后2小时血糖11.1mmol/l。OGTT按世界卫生组织要求进行

55、。符合上述标准之一的患者，在另一天重复上述检查，若仍符合三条标准之一，即诊断为糖尿病。糖耐量试验服糖后2小时血糖7.8mmol/l，但又低于11.1mmol/l诊断为糖耐量减低。空腹血糖高于或等于6.1 mmol/l，但又低于7.0 mmol/l诊断为空腹葡萄糖受损。技术路线 考虑到T2DM属于多基因复杂性疾病，并且以散发为主，所以，T2DM的易感基因的寻找不适合使用家系资料的连锁分析。此外，T2DM的发病有增龄性变化的特征，所以从家系入手进行传递不平衡检验也不能作为首选研究策略。本研究采用四步法进行T2DM易感基因的关联筛查和验证工作，以散发群体筛查为主导，小家系进行垂直验证为辅助参考，主要

56、技术路线设计如下图：T2DM诊断，样本采集，流行病学调查 基因组DNA提取、生化指标测定小样本直接扫描PPARGC1编码区和启动子区SNP，进行预筛查，根据MAF、杂合度等信息，选择进入后续研究。小群体等位基因分型，进行单基因遗传学分析，根据HWE、分布显著性、Oneway ANOVA、LD及Logistic去除混杂后，选择SNP进入后续研究第一步第二步阳性SNP利用核心小家系验证，通过传导不平衡检验和同胞对检验分析去除人群分层后阳性突变位点在家系中的传递规律传递与环境因素的交互作用分析，寻找发病原因的证据：探索PPARGC1的分子机制T2DM大群体中等位基因分型，进行多因素分析，根据HWE检

57、验、分布显著性、LD及单体型构建，分析基因互作效应，比较基因型间临床指标差异第三步第四步可行性分析： 目前已完成北方125个家系及散发病例320名和正常对照320名的调查工作，获取到血样、提取出DNA，完成了生化指标的检测工作同时，进行了环境、遗传因素的调查也数据初步分析。验证了2个PPARGC1易感基因与T2DM关联的多态性位点，同时做了家系传递分析及基因间交互作用的分析。正在补充完善家系资料及资料搜集工作。方法成熟、技术路线可行。 前期的国家自然科学基金项目的进行为本研究积累一定的工作基础。采样过程中我们注意了医学伦理问题：在目前的医学工作中面临诸多严峻的伦理问题，如遗传信息的隐私权问题、

58、基因组图谱的信息使用与人的社会权利、基因组研究成果应用的不可预测性等。我们已经注意到这一问题，并提请哈尔滨科大学医学理论委员会论证，最终获得批准通过。因此我们在项目申请的过程中，已经着手准备妥善解决此问题，如果基金申请顺利通过，我们有能力解决好次问题。并将严格实行知情同意制度，每位患者均签署知情同意书，并与患者保持密切联系，及时将研究成果向患者反馈，维护患者的权益。 本项目的特色与创新之处： 分子生物学与社会医学研究方法相结合，遵循现代社会医学研究模式为本项目特色 近年，随着分子生物学理论及技术的发展，尤其是人类基因组计划研究迅速进展和突破、基因定位技术经验的积累及统计分析方法的进步，使得2型

59、糖尿病的分子遗传学研究有了长足进展。阐明参与2型糖尿病的易感基因种类、特性及机制是2型糖尿病分子遗传学研究的目标之一。目前比较常用的是采用候选基因的功能区或非功能区多态标记进行。本项目将从预防医学、基础医学、社会医学研究三个层次对北方地区T2DM的流行现状、致病的遗传、环境、社会因素的交互作用研究。进而为使得T2DM的预防治疗遵循现代社会医学模式奠定基础。 群体关联分析，或是采用随机DNA位点或候选基因的高杂合度非功能区多态标记进行家系分析。2型糖尿病受到遗传基因与环境条件的双重调控。不同遗传背景的人群糖尿病易感性的主效基因可能有较大的差异。以往在不同群体进行易感基因的关联研究发现，同以易感基

60、因在不同群体中作用具有差异性。所以对于在其他人群所发现的易感基因，在中国北方人中重新评价其遗传与环境的交互作用就显得非常必要，探讨易感基因的分子机制在T2DM发病中的作用及其影响更有特定的价值。年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）年度研究计划：本研究预计执行期为3年，具体阶段计划于目标为：2011年1月-2011年4月查阅文献，撰写开题报告；设计调查表、确定遗传因素和环境因素的变量。2011年5月-2011年12月开展流行病学调查和体验工作进行家系和散发病例收集及血样采集、进行预实验2012年1月-2012年4月完成DM和IGT家系血样、家系遗传和