mPEG修饰红细胞Rh抗原稳定性的研究

1、mPEG修饰红细胞Rh抗原稳定性的研究邱艳，查，檀英霞，章扬培【摘要】本研究旨在探究PEG修饰的红细胞Rh抗原的稳定性。使用红细胞膜卵白SDS电泳技能阐发PEG修饰后红细胞膜卵白与PEG结合环境，用红细胞血影凝集实行及4PD调养液保存的修饰红细胞与匹配血液体外混血实行，不雅察PEG修饰后红细胞Rh抗原被掩藏的稳定性。效果创造：差异保存时间的PEG修饰的红细胞在模拟输血即混血前后的血型保持稳定，同时PEG修饰的红细胞在保存历程中游离血红卵白程度正常，而且混血后经37孵育的PEG修饰的红细胞游离血红卵白程度低于不混淆的修饰的红细胞。比力阐发PEG特异的碘染和考马斯亮蓝染的显色图谱创造，特别的碘染表

2、现出PEG与红细胞膜卵白结合的条带，PEG-SPA与红细胞膜卵白结合后导致卵白分子迁徙速率产生改变。PEG修饰的红细胞血影凝集实行证明，修饰红细胞在质膜裂损后PEG仍有用地掩藏抗原。结论：PEG-SPA岂论在红细胞膜卵白被单独提取后，照旧膜破坏后以及存活状态下，均能与红细胞膜卵白安定结合。【关键词】PEG修饰红细胞；Rh抗原；红细胞RhAntigenStabilityfPEGdifiedRedBldellsKeyrdsPEGdifiedredbldell;Rhantigen;redbldellPEG-SPA可以与卵白质和多肽中的赖氨酸K、精氨酸(R)的胺基、组氨酸(H)的咪唑基以及酪氨酸(Y)

3、的羟基产生化学反响，形成共价结合键，从而结合到卵白质多肽上1，到达掩藏抗原的作用。PEG与红细胞膜Rh抗原结合后是否稳定，进入人体后是否会脱落，这些题目干系到修饰后红细胞进入人体后的宁静性。为此，我们接纳PEG修饰的红细胞膜卵白SDS电泳、红细胞血影凝集实行以及用4PD调养液保存的修饰红细胞与匹配血液举行的体外混血实行，对PEG修饰后红细胞Rh抗原被掩藏的稳定性举行了开端的研究。质料和要领样品20l/LPEG-SPA修饰的AB、RhDEe红细胞，AB、RhD-全血，RhD+血液血浆。试剂PD调养液、低渗磷酸缓冲液20S，pH7.4、10l/LTris-盐酸低渗缓冲液、等渗液、电泳缓冲液、30%

4、聚丙烯酰胺凝胶溶液、分散胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%分散胶、10%下层胶、0.25%考马斯亮蓝R-250、脱色液、样品处置惩罚液、卵白分子量尺度物arker。仪器倒置显微镜、KUBTA2100离心机Japan、EBA12RZentrifugen低温高速离心机Bekan公司产物，Gerany、XTB数显调治仪水浴锅浙江余姚产业仪表二厂产物、ini-Prtean型电泳仪Bi-Rad公司产物，USA、TS-1型脱色摇床江苏海门其林贝尔仪器制造产物。PEG修饰红细胞体外稳定性检测将PD保存的血比容为35%的20l/LPEG-SPA修饰的ABRhDEe红细胞、ABRhD-全血、RhD+血浆分装，于2-

5、6保存并在储存第1、7、14、21天时取PD保存的修饰的ABRhDEe红细胞50l，用间接抗人球卵白试验断定血型后，别离参加250l的ABRhD-全血和RhD+血浆，以PD保存的血比容为35%的20l/LPEG-SPA修饰的ABRhDEe红细胞RhD-全血和RhD+血浆作为比较，在37动摇孵育24小时后，再次检测血型和血浆游离血红卵白。PEG修饰的红细胞血影凝集实行取未修饰和修饰的红细胞各40l，加10倍体积的PBSpH7.4，4安排30分钟，3500g/in离心10分钟，弃上清，参加600l的低渗磷酸缓冲液，4安排30分钟，3500g/in离心10分钟，弃上清，低渗磷酸缓冲液洗涤4次，350

6、0g/in离心10分钟，沉淀即为血影细胞。在血影细胞参加Rhanti-D多抗后，在倒置显微镜下不雅察效果。PEG修饰的红细胞膜卵白的SDS阐发红细胞膜卵白的提取取PD抗凝血100l，以2000g/in10离心5分钟，撤除血浆和灰白色血细胞层；另取PEG-SPA修饰红细胞约40l，加预冷的等渗液将沉淀RB悬浮，以2000g/in10离心5分钟，撤除上清液，云云重复洗涤3遍；按110v/v向沉淀RB中参加预冷的低渗液，混匀后4安排至红细胞完全溶血；以1000g/in，4离心10分钟，撤除上清液，将沉淀在4用低渗液6000g/in离心5分钟，洗涤3次，得到白色的RB膜样品。电泳别离配制10%分散胶和

7、下层胶，灌分散胶，37安排40分钟，待胶凝固，灌下层胶，放梳子组装电泳装置；将卵白arker及获得的RB膜样品各10l与5样品缓冲液在Eppendrf管中混淆；95加热5分钟，将卵白变性；用微量加样枪将样品参加样品孔底部；180V恒压电泳至溴酚蓝指示剂挪动至电泳胶外。PEG碘染色2将电泳后的胶放入容器内，在摇床上迟钝振荡的历程中参加20l0.1l/L的高氯酸，15分钟后依次参加5l5%氯化钡，2l0.1l/L碘溶液。5分钟后见到碘染的PEG条带渐渐出现，照相、记载效果。考马斯亮蓝染色将碘染的胶放在蒸馏水中漂洗约20分钟，碘染条带渐渐消散；将约20l考马斯亮蓝染液放入盛胶的容器里，摇床迟钝振荡约

8、2小时，将染液弃去，再在水中漂洗数次，然后参加脱色液，脱色的条带清楚，配景变浅，此中调换脱色液数次，照相、记载效果。统计学处置惩罚接纳SPSS10.0软件对检测效果举行hi-square查验。效果PEG修饰红细胞体外稳定性修饰的ABRhDEe红细胞在储存历程中和模拟输血历程即与全血和血浆混淆后于37孵育24小时,Rh血型D、E、e、h和抗原未产生变革，PEG修饰红细胞在保存历程中血浆游离血红卵白程度正常，修饰的ABRhDEe红细胞在模拟输血历程后，游离血红卵白未见升高，反而低落，且1组和6组在统计学有明显差异，1组和7组在统计学同样有明显差异附表。Table.Plasafreeheglbinh

9、angeinthepressfbldixture略PEG修饰的红细胞血影凝集PEG-SPA修饰前后的红细胞处置惩罚得到的血影和IgGRhD多克隆抗体，用直接凝集实行举行断定，效果表白PEG修饰前的红细胞产生了凝集，而PEG-SPA修饰后的红细胞未产生凝集图1。讨论PEG与红细胞膜只有稳定结合，才气包管其输入人体后不脱落，被修饰的抗原不会表露，因此不会导致机体产生免疫应答反响。在对重组卵白、酶、药物等的应用和研究底子上创造，PEG与卵白分子共价结合后会进一步吸附水分子，使卵白分子具有一个PEG和水分子包裹亲水外壳，这个外壳能有用地掩藏卵白质外貌的抗原3。已有研究效果表现，Rh血型抗原膜外的1、2

10、、3、4、5环上均存在与PEG-SPA产生反响的氨基酸K、R、H和Y，后者是PEG共价结合卵白质氨基酸物质基矗因此，从理论上讲结合应是稳定的。由于如今缺乏成熟的修饰红细胞动物评价模子4，因此我们方案了PEG修饰红细胞体外稳定性实行，效果表白：差异保存时间的PEG修饰的红细胞在模拟输血即混血前后的血型保持稳定，这一效果不但支持修饰的红细胞血型在体外稳定，而且也提示其进入体内应是稳定的；同时PEG修饰的红细胞在保存历程中游离血红卵白程度正常，而且混血后经37孵育的PEG修饰的红细胞游离血红卵白程度低于不混淆的修饰红细胞，这不但说明PEG与红细胞的结合是安定的，同时表白全血和血浆与保存期间的PEG修

11、饰红细胞混淆，不但不会导致红细胞布局和成效损伤，而且有利于PEG修饰红细胞成效维持和规复，PEG仍安定与红细胞结合起着掩藏抗原的作用。，SDS电泳阐发可以表现红细胞膜上分子量从15000-250000的15种重要卵白，包罗血影卵白spetrin，：240000；220000、锚卵白ankyrin、条带3(：100000)、条带4.1、条带4.2、肌动卵白atin和血型糖卵白(glyphrin，:300005。Stt等6研究效果表白，与PEG结合的膜卵白会由于分子量的改变使电泳的带型产生变革，而且表示出剂量依靠性；而且已有的效果也表白，PEG可以与红细胞膜卵白血影卵白、条带3、条带4.1、条带4.2、肌动卵白和血型糖卵白结合7。本研究中对保存期21天PEG-SPA修饰的红细胞膜卵白经SDS电泳后，先用碘染色，脱色后再用考马斯亮蓝染色，比力阐发PEG特异的碘染和考马斯亮蓝染色显色图谱，创造特别的碘染色可以表现出PEG与红细胞膜卵白结合的条带，PEG-SPA与红细胞膜卵白结合后导致卵白分子迁徙速率产生改变。这