双向电泳技术手册

1、双向电泳技术手册之四:胶蛋白质点的检测(考染和银染)第四章2-DE胶蛋白质点的检测2-DE胶蛋白质点的检测方法大致有：1)考马斯亮兰染色法；2)银染法；3)负染法；4)荧光染色 法；5)放射性同位素标记法等。这几种检测方法的灵敏度各不相同。目前最常用的是银染法和考染法。 由于银染的灵敏度是考染的50倍，故一般用银染法进行分析处理，再用考染法来进行样品微量制备。4.1考马斯亮兰染色：4.1.1经典的考马斯亮兰染色程序：1固定20 % TCA1h2染色0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid2h3脱色40% EtOH&10% acetic acid2x 30 min

2、4强化1% acetic acidovernight5清洗deionized H2O30 min局限：灵敏度低(1gg protein/spot)4.1.2 Neuhoff胶体考染法：1固定：12%(w/v)三氯醋酸(TCA) 2h2染色：200ml染色液混合50ml甲醇 16-24h染色液：在490ml含2%(w/v)的H3PO4中加50g (NH4)2SO4直至完全溶解，再加0.5g CBB G-250 (已溶于10mlH2O中)，搅拌混合。无需过滤，使用前摇匀。3漂洗：0.1mol/L Tris-H3PO4 缓冲液(pH 6.5)漂洗两分钟;25%(v/v)甲醇漂洗不超过1min4稳定：

3、在20%的(NH4)2SO4中稳定蛋白质一染料复合物。优点：背景低，灵敏度高，可达到200ng protein/spot.4.1.3热考马斯亮兰染色及二次染色法：1染色(0.025%(w/v)考马斯亮兰R350):将1片Phast Gel Blue药片溶入1.6L 10%醋酸，将染色液加 热到90C倒入凝胶染色盘，振荡10min；2脱色：10%醋酸室温振荡脱色2h ,期间需多次更换脱色液，脱色液可通过铺有活性炭的滤纸层过滤回收； 脱色液和染色液可重复使用。脱色后的凝胶可进行扫描分析，选中的点可用Spot Picker自动切胶仪挖出，再进行后续的硝酸银染色 可得到更多的蛋白点。用考马斯亮兰预染过

4、的胶再进行银染灵敏度比单独银染更高，且热染过程迅速。二次染色待考马斯亮兰染色后的背景完全脱除后，可用以下的银染法进行二次染色。因为蛋白点已经 经过固定，可直接从敏化步骤开始染色。4.2硝酸银染色：银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。 大致的原理是银离子在碱性pH环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D凝胶分析上。待找到 自己感兴趣的蛋白质点后，再通过考染富集该目的点，然后做进一步的肽段指纹图谱分析(PMF)或序列 测定。随着质谱技术的不断完善和发展，对银染后的

5、f mol级的蛋白质点直接测定已非难事。这里介绍一 种可兼容质谱分析的银染方法，实验程序如下：StepSolution (250ml per gel)Gel Type1mm unbacked1mm on film or glass support or 1.5 unbacked固定25 ml acetic acid, 100ml methanol， 125ml milli-Q water2x15 min2x60 min敏化75ml methanol, 0.5g Na2S2O3, 17g NaAc, milli-Q water to 250ml30 min60 min漂洗250ml milli-

6、Q water3x5 min5x8 min银染0.625g AgNO3, milli-Q water to 250ml20 min60 min漂洗250ml milli-Q water2x1 min4x1 min显色6.25g Na2CO3, 100|il formaldehyde, milli-Q water to 250ml4 min6 min终止3.65g EDTA, milli-Q water to 250 ml10 min40 min漂洗250ml milli-Q water3x5 min2x30 min银染注意事项：.很多银染程序都使用了戊二醛(glutardialdehyde)，它能提高银染的灵敏度和染色结果的重复性，但 是因为戊二醛会修饰蛋白质，从而会影响对蛋白质点的质谱鉴定和分析；.保证所有的染色器皿绝对的干净，可使用玻璃或塑料做染色器皿；.水的纯度对染色结果好坏