PCR常见问题及解决方案

1、PCR专题讲座- PCR常见问题分析及解决方案 PCR实验中常用的策略实时荧光PCR技术的原理及应用主讲人 市场部 许 欣免费咨询：800-810-2177PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg2 dNTP ddH2O 耐热聚合酶免费咨询：800-810-2177反应体系对PCR扩增的影响纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应DNA模板完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物浓度 加量过多导致非特异性扩增增加特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体完整性 避免反复冻融引 物浓度 应适当0.1-0.5umol/L, 过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少免费咨询：800-81

2、0-2177反应体系对PCR扩增的影响pH值,盐离子浓度反应Buffer稳定剂,增强剂过高非特异性严重过低无扩增产物Mg 2浓度浓度适当dNTP MixtureddH2O避免反复冻融pH值适当避免污染PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg2 dNTP ddH2O 耐热聚合酶免费咨询：800-810-2177如何选择合适的DNA聚合酶 DNA 聚合酶的特性 PCR 实验的不同需求免费咨询：800-810-2177如何选择合适的DNA聚合酶DNA聚合酶特性纯 度生产工艺、质量检测保存条件、是否降解稳定性Taq 酶酶活性活性改变免费咨询：800-810-2177如何选择合适的DNA聚

3、合酶PCR实验需求特 异 性保 真 性基因组扩增、RT-PCR基因筛选、测序、 TA克隆长片段扩增 构建基因图谱 测序 分子遗传学、扩增效率复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）PCR试剂盒复杂模板扩增、大规模基因检测免费咨询：800-810-2177特异性 热启动Taq酶原 理特 点用 途 蜡封 避免非特异性扩增 提高PCR反应的特异性 抗体抑制 化学修饰 基因组扩增 RT-PCR免费咨询：800-810-2177特异性 热启动Taq酶产 品 类 型产 品 名 称产 品 性 能 TIANGEN: HotStart Taq Roche : FastStart Taq化学修饰 Abgene: Th

4、ermo-start DNA Polymerase 大大提高PCR反 Stratagene: SureStart Taq应的特异性 Invitrogen：AccuPrimeTM Taq Platinum抗体抑制蜡封 TaKaRa：ExTaqTM HotStart Version Promega：TaqBeadTM HotStart 化学修饰不影响后续实验免费咨询：800-810-2177保真性 高保真酶原 理用 途 35核酸外切酶活性 降低碱基错配率表达基因的克隆基因的定点突变 细胞内基因点突变分析（SNP）免费咨询：800-810-2177保真性 高保真酶产 品 类 型生 物 公 司产 品

5、性 能TIANGENStratagenePromegaPfu DNA Polymerase在目前已发现的所有耐热聚合酶中, Pfu保真度最高，碱基错配率最低PyrobestTM DNA PolymeraseTaKaRaTli DNA PolymerasePromega免费咨询：800-810-2177高保真高扩增效率原 理用 途 混合酶 超长片段扩增 测序热启动耐热聚合酶 35核酸外切酶不同比例混合构建基因图谱 复杂模板扩增 GC含量高二级结构免费咨询：800-810-2177高保真高扩增效率产 品 类 型产 品 名 称产 品 性 能 TIANGEN：Taq Plus高扩增效率复杂模板扩增 T

6、aKaRa：Ex TaqTM TIANGEN：Taq Platinum保真度仅次于Pfu聚合酶，但扩增效率较高高保真 Invitrogen：Pfx Platinum Taq DNApolymerase High Fidelity TIANGEN：Long Taq特别适用于保真度较高的超长片段扩增 TaKaRa：LA Taq长片段扩增 Invitrogen：Elongase Amplificaiton System免费咨询：800-810-2177PCR MasterMix超强扩增原 理预配好的PCR反应液DNA聚合酶反应缓冲液dNTPPCR增强剂、优化剂免费咨询：800-810-2177PCR

7、 MasterMix特 点 快速简便 减少加样误差和污染 灵敏度高 可扩增低拷贝的目的模板 特异性强 降低PCR反应的要求，增强特异性 稳定性好 长期放置活性无改变 大规模基因检测适用范围 目的基因拷贝数极低的样本 GC含量高,有二级结构的模板 复杂基因组样本 基因点突变检测,可直接检测菌落免费咨询：800-810-2177TIANGEN产品导航耐热聚合酶MasterMix荧光定量PCR6种耐热DNA聚合酶6种PCR MasterMixPCRdNTP等试剂反转录酶RT-PCR一步法RT-PCR免费咨询：800-810-2177TIANGEN产品导航耐热DNA聚合酶Taq 扩增效率最高，Pfu

8、保真度最高，种类齐全Taq plus适合扩增 GC 含量高等复杂模板，Hotstart Taq 特异性好，Taq Platinum 集高保真、高特异和高扩增效率于一体纯度高此六类酶都经过严格的过柱纯化，不存在宿主菌DNA 和宿主蛋白的污染质量稳定 每批酶的分离纯化及其质检过程均相同，一般不会存在批次间的不同稳定性好室温放置 6 个月，活性没有明显下降免费咨询：800-810-2177TIANGEN产品导航PCR MasterMix超强扩增完美解决PCR扩增无产物、扩增效率低等问题！Taq MasterMix扩增效率最高Pfu MasterMix保真度最高HotStart Taq MasterM

9、ixTaq plus MasterMixLong Taq MasterMixTaq Platinum MasterMix特异性最强集扩增效率高和保真度好于一体特别适合于长片段扩增高保真、高扩增效率、高特异性免费咨询：800-810-2177PCR 常见问题及解决方案 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性免费咨询：800-810-2177PCR 常见问题之一 无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无；M样品 样品 正对照免费咨询：800-810-2177PCR 常见问题之一 无扩增产物原因1. 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA2. 更换Buffer或调整浓度1. 模板:含有抑制物，含量低2

10、. 该Buffer对样品不合适3. 引物设计不当或者引物发生降解4. 反应条件：退火温度太高延伸时间太短对 3. 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结策构）或者换一管新引物4. 降低退火温度、延长延伸时间免费咨询：800-810-2177PCR 常见问题之二 非特异性扩增现象： PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。免费咨询：800-810-2177PCR 常见问题之二 非特异性扩增原因1. 重新设计引物或者使用巢式PCR1. 引物特异性差2. 引物浓度过高3. 酶量过多4. Mg2+浓度偏高5. 退火温度偏低6. 循环次数过多2.

11、适当降低引物浓度适当减少酶量对策3.4.降低镁离子浓度5. 适当提高退火温度或使用二阶段温度法6. 减少循环次数免费咨询：800-810-2177PCR 常见问题之三 拖尾现象现象：产物在凝胶上呈Smear状态。M12免费咨询：800-810-2177PCR 常见问题之三 拖尾原因1. 适量用酶2. 纯化模板3. 减少循环次数1. 酶量过多2. 模板不纯3. 循环次数过多4. dNTP、Mg2+浓度偏高5. 退火温度偏低6. Buffer不合适对策适当降低dNTP和镁离子的浓度4.5. 适当提高退火温度6. 更换Buffer免费咨询：800-810-2177PCR 常见问题之四 假阳性（筛选转

12、基因、检测基因表达情况)现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交叉污染对策：1. 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。免费咨询：800-810-2177PCR专题讲座 PCR常见问题分析及解决方案 PCR实验中常用的策略实时荧光PCR技术的原理及实验应用免费咨询：800-810-2177PCR实验中常用的策略 提高PCR反应特异性 提高PCR反应保真度 PCR扩增长片段DNA免费咨询：800-810-2177提高PCR反

13、应特异性的策略 巢式PCR（Nest-PCR） 递减PCR（TouchDown PCR） 热启动PCR（HotStart PCR） 使用PCR增强剂免费咨询：800-810-2177提高PCR反应特异性的策略- 巢式PCR（Nest-PCR）P4P2P1P3 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。免费咨询：800-810-2177提高PCR反应特异性的策略- 递减PCR（TouchDown PCR） 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退

14、火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。免费咨询：800-810-2177提高PCR反应特异性的策略- 热启动PCR（HotStart PCR） 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度； 现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用； 热启动PCR是除了好的引

15、物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。免费咨询：800-810-2177提高PCR反应特异性的策略- 使用PCR增强剂 甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。 其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 增强剂浓度要适当免费咨询：800-810-2177提高PCR反应保真性的策略- 保证模板DNA的质量（未受射线及化学药品的作用） 反应体系中具有合适的离子浓度 确保引物序列的正确, 避免错误碱基配对 在反应体系中加入有纠错功能的高保真酶(如 Pfu DNA聚合酶) 使用具有高保真性能的混合酶,以提高扩增效率免费咨询：800-8

16、10-2177PCR扩增长片段DNA的策略- 长片段DNA难以扩增的原因 DNA聚合酶 普通Taq酶缺乏3-5核酸外切酶活性 DNA模板较长的模板DNA难以充分变性,并容易形成高级结构, 抑制DNA聚合酶与模板的充分结合 反应缓冲液 长时间的高温反应使缓冲液的缓冲能力下降,造成模板和产物DNA的破坏二价阳离子在高温条件下促进DNA的降解免费咨询：800-810-2177PCR扩增长片段DNA的策略- DNA聚合酶 使用具有35核酸外切酶活性和扩增效率高的两种聚合酶，调整两者的比例，以利于长片段的扩增 DNA模板 引物 设计制备较高纯度的DNA模板30-35个碱基,避免形成二级结构和引物二聚体引

17、物3端应与模板严格配对, 解链温度趋向相等 反应缓冲液 选择有效的缓冲体系, 避免二价阳离子浓度过高 PCR反应条件 摸索合适的变性温度、反应时间和循环次数免费咨询：800-810-2177PCR专题讲座之实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)免费咨询：800-810-2177实时荧光定量PCR 原理实时原理常 规 PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进

18、行定量分析免费咨询：800-810-2177实时荧光定量PCR原理定量原理如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值免费咨询：800-810-2177实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线荧光基团扩增曲线图：荧光检测元件横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集免费咨询：800-810-2177实时荧光定量PCR 原理 -荧光域值荧光信号的域值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的

19、荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值免费咨询：800-810-2177实时荧光定量PCR 原理 -Ct值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t) value免费咨询：800-810-2177实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性免费咨询：800-810-2177实时荧光定量PCR 原理 - 标

20、准曲线 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量免费咨询：800-810-2177实时荧光定量PCR原理 绝对定量确定未知样品的 C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample25免费咨询：800-810-2177实时荧光定量PCR 原理 - DNA 产物的荧光标记非特异性荧光标记：1、 SYBR Green特异性荧光标记：2、TaqMan3、Molecular BeaconQQ4、AmplisensorR免费咨询：800-810-21

21、77实时荧光定量PCR 方法 1 -SYBR Green 法SYBR Green免费咨询：800-810-2177SYBR Green 法工作机理 SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。免费咨询：800-810-2177SYBR Green 法工作机理SGSG53ExcitationNo EmissionSGSG35ExcitationSGSGSG SGSGEmission5335SGSG免费咨

22、询：800-810-2177实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析荧光强度Tm温度Tm值：DNA解链一半时的温度免费咨询：800-810-2177实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析-dIdTTm 将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)免费咨询：800-810-2177SYBR Green 法熔解曲线分析熔解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确非特异性产物熔解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确免费咨询：800-810-2177SYBR Green 法 -PCR反应的建立反应体系的建立及优化:1. SYBR Gre

23、en 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2. Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3. MgCl2的浓度:可以降低到1.5 mM,以减少非特异性产物4. 反应Buffer 体系的优化5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定6. 其他与常规PCR相同免费咨询：800-810-2177TIANGEN公司利用SYBR Green 法定量检测样品DNA免费咨询：800-810-2177SYBR Green 法应用范围 起始模板的测定 基因型的分析 熔解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二

24、聚体、变异产物、多种产物。免费咨询：800-810-2177SYBR Green 法优缺点优 点缺 点 对DNA模板没有选择性-适用于任何DNA 使用方便 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过熔解曲线的分析，优化反应条件-不必设计复杂探针 非常灵敏 对引物特异性要求较高 便宜免费咨询：800-810-2177实时荧光定量PCR 方法2 -TaqMan法TaqMan-水解型杂交探针与目标序列互补 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发

25、荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针免费咨询：800-810-2177TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光免费咨询：800-810-2177TaqMan 法 PCR反应的建立-引物、探针设计 引物设计原则：a. 引物与模板的序列要紧密互补，避免错配b. 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构d. 引物长度通常20-25bp,Tm值55-65,GC含量40-60%,产物大小在100-250bp之间。f. 引物的3端避免使用碱基A、避免出现3 个以上连续相同的碱基。 探针设计原则：a. 探针位置尽可能地靠近上游引物。b. 探

26、针长度通常20-30bp，Tm值65-70，通常比引物高5-10，GC含量40-70%。c. 探针5端避免使用碱基G，整条探针中碱基C的含量要明显高于G含量。 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在BLAST中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。(www.ncbi.nlm.nih/blast)免费咨询：800-810-2177TaqMan 法 PCR反应的建立-反应体系优化 优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值：引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM 反应参数的确定：一般为：94 ，10-20S60，30-60S（Taq酶53外切核酸

27、酶活性在60 最高）也可通过温度梯度优化退火温度72 ，45 S免费咨询：800-810-2177TIANGEN公司利用TaqMan法 检测血液中的HBV乙肝病人血液中HBV的绝对定量 目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测 设置对照：浓度为10 、10 、10 、 10 的标准样品各一个，设阴性和空白对照6543 实验步骤：提取HBV DNA设计特异引物设计TaqMan探针并标记探针扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数免费咨询：800-810-2177TIANGEN公司利

28、用TaqMan法 检测血液中的HBV数据分析分析结果： HBV DNA的精确copy数为3.7X105免费咨询：800-810-2177TaqMan法应用范围 起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 SNP分析免费咨询：800-810-2177TaqMan法优缺点优 点缺 点 对目标序列的高特异性-阴性结果确定 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针 设计相对简单-与目标序列某一区域互补重复性比较好免费咨询：800-810-2177实时荧光定量PCR 方法 3- Molecular beacon 法(分子信标)环标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎茎由互

29、补配对序列组成荧光素 淬灭剂免费咨询：800-810-2177Molecular beacon (分子信标) 工作原理RQ分子信标探针RQDNA模板FRET免费咨询：800-810-2177Molecular beacon (分子信标) 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 SNP（单核苷酸多态性）分析免费咨询：800-810-2177Molecular beacon (分子信标) 优缺点优 点缺 点高特异性：对目标序列 只能用于一个特定目标 设计困难检测SNP最灵敏的试剂之一 价格比较高荧光背景低免费咨询：800-810-2177实时荧光定量PCR法方法比较方法优点缺点适用范围SYBR Green 适用性广引物要求高适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究I 法灵敏方便便宜易出现非特异性带TaqMan 法 特异性高重复性好价格高病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核只适合特定目标遗传疾病的诊断Molecular 高特异性只适合特定目标特定基因分析SNP分析Beacon法(分子信标)荧光背景低 设计困难价格