磁分离酶联免疫荧光法（MEIF）检测人血清中胰岛素

1、磁别离酶联免疫荧光法MEIF检测人血清中胰岛素【摘要】目的:采用磁微粒别离酶联免疫荧光eif分析技术建立一种简便、高敏感性、定量检测人血清胰岛素(insulin)的新方法。方法:选用2株识别人胰岛素不同表位的单克隆抗体(ab)。一株ab用异硫氰酸荧光素fit标记,另一株用碱性磷酸酶(ap)标记;偶联羊抗fit抗体的磁珠用作固相别离载体,4-甲基磷酸伞型酮用作荧光底物。结果:成功建立了定量检测人血清胰岛素的eif,灵敏度2.0iu/l,线形范围0188.52iu/l,批内变异系数(v)为4.3%5.2%,批间v为2.6%9.5%,稀释回收率为93%117%,加标回收率为94%113%。实际样品的

2、测定结果与倍爱康公司商品化人insulin磁别离发光系统检测试剂盒的检测结果比拟,具有良好的相关性。结论:eif定量测定人insulin方法本钱低、灵敏度高、稳定性好,在临床免疫检测领域具有广阔的应用前景。【关键词】酶联免疫分析免疫荧光4-甲基磷酸伞型酮磁珠胰岛素establishentftheagnetiseparatinenzyeiunflureseneethdfrdetetinginsulinxiejing,liuzhen-shi,hushan,airu-xiu,yanghai,yangxiang-liang*llegeflifesieneandtehnlgy,huazhngsienea

3、ndtehnlgyuniversity,uhan430070,hinakeyrdsenzyeiunassay;iunfluresene;4-ethylu-belliferyl-phsphriaid;agnetibeads;insulin糖尿病是我国最常见的内分泌疾病,发病率约为1.3,我国每年约有2.7万新增患者。糖尿病给患者家庭和社会带来宏大的经济损失每年高达100亿人民币和沉重的精神伤害1。随着人们生活程度的进步和生活方式的改变,糖尿病发病趋于年轻化2。血清胰岛素insulin含量测定是糖尿病诊断和治疗过程中重要的血清检查工程,对于糖尿病的诊断和治疗具有重要意义。常规检测胰岛素的方法主要有

4、放射免疫法和酶联免疫吸附法等,但存在着放射污染或灵敏度低,操作复杂等缺乏。本研究旨在建立一种检测人血清胰岛素的新方法-磁别离酶免疫荧光法(agnetienzyeiunfluresene,eif),实现对人血清胰岛素的定量、敏感和快速检测。1材料和方法1.1材料4-甲基磷酸伞型酮4-up购自siga公司。磁别离试剂、洗液、胰岛素标准品及抗人胰岛素单克隆抗体abfit和ap连接物由北京倍爱康生物技术提供。二乙醇胺dea和三乙醇胺tea购自fluka公司。vitr型荧光检测仪为珀金埃尔默(perkineler)公司产品。专用于酶标板的磁别离器为自行研制。恒温箱为上海实验仪器公司产品。白色未标记酶标板

5、为greinerirln消费。1.2方法那么3选择标记抗体的最正确工作浓度。最正确条件通过对ap催化4-up反响条件的探究、优化;对各种检测条件如标准品、磁别离试剂、荧光底物和标记抗体用量,温育时间等条件进展全面探究后确定检测的最正确条件。比拟,明确该方法与现有商品化检测试剂盒的相关性。2结果2.1荧光的动力学性质在ap和4-up荧光体系中,将不同浓度的ap参加荧光底物中,荧光强度(fli)随ap的浓度和反响时间而变化。fli随反响的时间延长而增强。ap浓度在1g/l时,反响较快,180s左右,fli接近峰值,随后开场缓慢下降;但浓度低10个数量级以下时,反响10in,fli还未到峰值。fli

6、与ap浓度和反响时间关系参见图1。图1酶促荧光反响的动力学曲线略fig1kinetisurvesfenzye-aeleratingfluresene-senereatina:1g/lap;b:0.1g/lap;:0.01g/lap.2.2荧光的反响条件反响速度和fli的影响ap的适宜工作ph值为10114,而实验显示4-up在低ph值条件下易出现非酶水解而使本底增高。本研究中,分别以ph8.0、8.6、9.0、9.5、9.8、10.0和11的dea缓冲液配制荧光底物溶液,考察ph对fli的影响。实验发现不同ph底物与浓度一样的ap1g/l反响,fli峰值根本一致,ph11时反响到达峰值用时最短

7、(图2)。图2ph值对rli的影响略fig2effetfphnrlia:ph8.0;b:ph8.6;:ph9.0;d:ph9.5;e:ph9.8;f:ph10;g:ph11.反响10in后测定fli(图3)。实验说明,4-up浓度在0.125l/l以下时,rli随底物浓度的增加而接近线性增加,当底物浓度大于等于0.125l/l时,fli趋于平缓,故本实验采用4-up底物的浓度为0.125l/l。图3底物浓度对fli的影响略fig3effetfsubstratenentratinnflia:0.1l/l;b:0.125l/l;:0.2l/l;d:0.25l/l;e:0.3l/l;f:0.5l/l

8、.2.3确立的检测方法不同浓度的人胰岛素标准液a-f标准点浓度分别为0iu/l、11.36iu/l、23.22iu/l、55.61iu/l、126.36iu/l、188.52iu/l、质控液及待测血清样品用量分别为30l/孔,连接fit和ap的抗人胰岛素ab工作浓度分别为1.4g/l和2.0g/l,用量分别为15l/孔。将三者参加检测孔底部并混匀后,37温育30in。各孔包括空白孔参加磁别离剂40l,充分混匀后,37温育10in。将反响板安置在磁别离器上别离2in,倾倒上清液。磁珠用洗液清洗3次,每孔加洗液150l。最后参加4-up工作液150l/孔。混匀时开场计时,混匀30s,室温反响15i

9、n,在磁别离器上别离2in后,检测荧光强度。采用四参数拟合标准曲线,计算样品中胰岛素的含量(iu/l)。标准曲线参见图4。图4eif检测insulin标准曲线略fig4insulinalibratinurvebyeif2.4对eif的评价x和标准差s,将x+s值输入上述曲线拟合程序中,求出其浓度为理论检测的最小量,即灵敏度5。本实验测得灵敏度是2.0iu/l。x和标准差s,s/x即为变异系数v。实验说明,该方法批内v在4.3%5.2%。对3份不同浓度的insulin标本液分别进展3次检测,每次检测各浓度5次重复,实验显示批间v为2.6%9.5%。参加到3份样品中测定其insulin含量,计算回

10、收率为93%117%。将4份不同浓度的insulin高值血清作11116稀释后,测定insulin的含量,平均回收率为106%121%。比照试验同时用建立的磁别离荧光法和倍爱康公司的磁别离发光法检测50例患者血清中insulin的含量,显示相关性良好(r2=0.9798)。参加反响底物后分别在10、15、20、25、30in内,检测高、中、低3份含不同浓度insulin的患者血清,分别为(150.901.80)iu/l、(86.401.80)iu/l和(17.620.42)iu/l,v分别为0.4%、1.3%和2.4%。3讨论eif是将荧光测定技术引入磁别离酶联免疫检测系统中而建立的一种方法。

11、该法中所用的荧光底物4-up与ap作用,其磷酯键分解,脱磷酸根基团后形成4-甲基伞型酮(4-u)。它在360n激发光的照射下,发出448n的荧光,通过荧光分析仪可检测6,并且无放射污染。其较高的荧光值降低了背景干扰,进步了信噪比,增加了检测系统的灵敏度。4-up-ap荧光体系是最方便和灵敏的荧光分析系统之一,通过本次实验检测,对标记物ap的检测限可达10-15l/l,整个反响过程不超过1h。目前,由于商用化学发光底物完全依赖进口,且价格昂贵,高质量的低本钱免疫荧光技术难于实现。4-up作为荧光检测底物,不但进口价格低廉,还可以实现自行合成。采用板式反响形式,方便适用于任何一款板式荧光检测仪。我们建立了用eif检测人胰岛素的方法,并进展了初步鉴定。结果显示,当底物浓度为0.125l/l时,既能长时间保存78个月,又能充分满足反响体系中ap的含量,并且随着待测物浓度的增加,与荧光值呈现良好的线性关系,具备较高的灵敏度,可以满足检测的要求。而且该法批内及批间的v%较校经初步应用,该法与发光法的相关性良好,为该法的推广应用提供了实