PCR技术简介及案例分析（DNA聚合酶链反应）

1、PCR（DNA聚合酶链反应）聚合酶链反应体外扩增DNA已经成为应用最广泛的一种生物技术。最初采用Klenow酶来扩增DNA，但每次加热变性DNA都会使酶失活，需要重新添加DNA聚合酶，知道用耐热的TaqDNA聚合酶代替后，这项技术才成熟，从而得到各方面的应用。该技术基本步骤是：设计一对引物以便有效扩增所需的DNA序列，并尽量减少可能产生的非特异产物优化反应体系，以便获得最好的扩增效果。该反应体系包括适量模板（1ng-0.001ng），引物（-100pmol/100l），四种dNTP（200mol/L），TaqDNA聚合酶（2U/100l），和适量镁离子选择三个稳定进行热循环。这三个温度为：变性

2、：94摄氏度，45-60s；退火：（根据引物与模板的Tm值来定，一般为两引物中较低的Tm值减2），1mim；延伸：72摄氏度，1分钟，开始时热变性5-10min，热循环25-30个周期，最后延伸10min扩增完成后取出一定量反应产物，检测扩增结果。最普通的检测方法是进行凝胶电泳，用溴化锭染色，在紫外光下检查结果PCR技术十分灵敏，少数几个模板分子即可检查出来，其扩增效率非常高，通常可扩增十的六次方倍。产量公式如下：Y=产量 x=扩增效率 n=循环次数该技术可扩增任意DNA片段，只要设计出片段的两端引物。DNA正链5端的引物叫做正向引物、右向引物、上游引物、有义链引物及Watson引物，简称5引

3、物。与正链3端互补的引物叫做反向引物、左向引物、下游引物、反义链引物及Crick引物，简称3引物。PCR的最适条件首先是要设计好引物，设计引物的主要原则有引物长度要大于16个核苷酸，一般为20-24个核苷酸，因为4的十六次方大于哺乳动物单倍体基因组，故16个以上的核苷酸引物可防止随即结合引物与靶序列间的Tm值不应过低（一般不低于55摄氏度）。小于三十个核苷酸的引物按公式Tm=（G+C）4+（A+T）2来计算变性温度。引物不应该有发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列两引物间不应有大于4bp以上的互补序列和同源序列，在3端不应该有任何互补碱基。实验证明，两引物3端如果有两个互补碱基，经PCR可产

4、生显著的引物二聚体。引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量应接近百分之五十。PCR的应用：遗传病和某些疑难病的诊断以及孕妇的产前检查病原体的检测。某些恶性疾病用一般微生物学、生化和免疫学技术无法查出病原体时，可用PCR来检测法医和刑侦鉴定。PCR可灵敏检测出亲属间的亲缘关系，并对生物残留的痕量样品进行鉴定。因此，对刑侦极为有用癌细胞的检查基因探针的制备基因组测序、染色体巡视cDNA库的构建基因突变的分析和定位诱变DNA重组基因的分离和克隆一个学生在进行PCR实验时，预测可能出现的情况：（1）不小心一个引物忘记加入到反应体系中（2）在初始样品中只有一个拷贝，其中一条模板链断裂（3）退火温度设为4

5、5摄氏度（4）热盖温度设定为95摄氏度（5）一个引物能与初始DNA的多个位点互补。变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。盖子的高温主要是为了防止试管内水蒸气的形成，减少反应体系的损失。较好的 HYPERLINK /s?wd=PCR%E4%BB%AA&tn=44039180_cpr&fenlei=mv6quAkxTZn0IZRqIHckPjm4nH00T1Y1mv7hPAN-mWPbP16snjD30ZwV5Hcvrjm3rH6sPfKWUMw85HfYn

6、jn4nH6sgvPsT6KdThsqpZwYTjCEQLGCpyw9Uz4Bmy-bIi4WUvYETgN-TLwGUv3EPjbzPH0vrjDs t /question/_blank PCR仪反应金属槽可以达到的温度在-498之间，而PCR反应进行阶段，温度循环控制更多处于Taq酶活性最适温度72与DNA解链温度94之间。在这个温度区间内，反应液中的水分很容易蒸发掉，结果造成反应体系的不稳定，甚至反应体系中水分全部蒸发掉。这也是前人做PCR反应加入矿物油进行液封的原因。热盖温度105，超过水的沸点，避免高温产生的水蒸气凝结在PCR管盖上，可以防止水分蒸发后对PCR反应体系造成较大影响。是PCR反应成功的保证PCR反应中，（1）检