不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

1、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳第1页，共11页，2022年，5月20日，0点53分，星期日实验原理电泳：带电粒子在电场中泳动的现象。泳动的速度取决于粒子带电的多少、分子的大小和形状聚丙烯酰胺凝胶电泳：被电泳的物质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，分出的组分形成不连续的圆盘形区带。聚丙烯酰胺凝胶电泳具有电泳和分子筛的双重作用。第2页，共11页，2022年，5月20日，0点53分，星期日不连续体系：凝胶孔径大小不连续缓冲溶液成分和 pH 不连续电场中形成电位梯度不连续 样品在浓缩胶中，浓缩成很薄的区带，通过3个物理效应，进行电泳分离。3个物理效应：浓缩效应、电荷效应、分子筛效应实验原理小分子蛋白质在前，大分子蛋白

2、质在后电荷多蛋白质在前，电荷少蛋白质在后第3页，共11页，2022年，5月20日，0点53分，星期日操 作 步 骤 一、制备凝胶 玻管直径0.6cm，长10cm。底部用白色胶塞封口，中间用绿色胶塞固定1. 分离胶：过硫酸铵-TEMED系统，化学聚合依次加入 A:C:H:G 20mL 轻搅匀 2 4 4 10 mL沿管壁滴入封顶液X 3滴 15-20分成胶 甩去封顶掖(底部绿胶塞顶部7cm）沿玻管壁加至绿胶塞顶部高度 第4页，共11页，2022年，5月20日，0点53分，星期日2. 浓缩胶：核黄素-TEMED系统，光聚合依次加入 B:D:E:F 8mL 轻搅匀 1cm/管1 2 1 4 mL 封

3、顶液X 3滴 垂直放入圆盘电泳仪孔中 紫外线照射5-10分成胶 甩去封顶掖电极缓冲液浓缩胶 1cm 分离胶 7cm 操 作 步 骤 样品 绿色胶塞 上电泳槽下电泳槽电极缓冲液第5页，共11页，2022年，5月20日，0点53分，星期日二、安装凝胶管 1. 去除白胶塞，将凝胶小玻管依次垂直安装注意：不能漏水，上槽先加少许缓冲液M检漏三、加样样品处理：血清(生理盐水稀释)+甘油+溴酚蓝加样：微量加样器沿壁加样100微升操 作 步 骤 2. 电泳仪下槽加电极缓冲液，应浸没下槽在电泳仪上槽小孔内, 塞紧绿胶塞。中的电极及小玻管的下端第6页，共11页，2022年，5月20日，0点53分，星期日操 作 步

4、 骤 四、加电极缓冲液1. 玻管凝胶样品上方，电极缓冲液M沿壁缓慢2. 上槽加电极缓冲液M浸没玻管顶部及加入，封满玻管圆盘电泳仪盖上的电极 第7页，共11页，2022年，5月20日，0点53分，星期日操 作 步 骤 五、通电电泳时间1小时 绿胶塞下出现染料蓝色带 关电泳仪开关 拔电源插头 取下电极线取玻管 倒去上槽中的缓冲液通直流电. 恒流 接电极线 红A黑 红B黑 + -下槽 上槽电压180-400v（自动，不用调）3mA/管，312管=36mA 324管=72mA 一拖二600v 100mA 恒流 开推进 推进 不推 推进 调整 调整mA 36 mA/72mA 电泳仪第8页，共11页，20

5、22年，5月20日，0点53分，星期日六、固定、染色、脱色（集中进行） 长针头沿玻管壁插入凝胶中旋转打入下槽中的缓冲液，将凝胶滑入烧杯中固定：在培养皿中，用固定液N固定5-10分操 作 步 骤 染色：倒去固定液，用染色液O染色30秒脱色：倒去染色液自来水冲洗洗脱液P漂洗3-4次底色浅，区带清晰无色透明凝胶 乳白色蛋白质带、染料的蓝色带胶全黑胶蓝色、蛋白质蓝黑色带第9页，共11页，2022年，5月20日，0点53分，星期日结果分析一、 浓缩胶中的浓缩效应二、 分离胶中的蛋白质分离第10页，共11页，2022年，5月20日，0点53分，星期日注 意 事 项 1.制备凝胶的高度，可用绿色胶塞固定位置2.固定、染色、脱色：集中进行3.每台共用：分离胶20mL、浓缩胶8mL