工具酶与基因工程

1、 第一部分 工具酶与基因工程 一限制性核酸内切酶 1限制性核酸内切酶的发现 2I类和III类限制和修饰酶的基本特征 3II类限制和修饰酶的基本特征 4甲基化酶的基本特征 二其它工具酶 1 DNA连接酶 2聚合酶 3末端脱氧核苷酰转移酶(TdT) 4. SI核酸酶 5Bal31核酸酶 6碱性磷酸单脂酶 限制性内切酶 (Restriction Endonuclease)* 存在于任何一种原核细菌中.* 在特异位点上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性片段.* 各种生物呈现特征性的限制性内切酶切图谱.* 在生物分类,基因定位,基因重组,疾病诊断,刑事侦察领域极为重要.一限制性内切酶的发现：(宿

2、主细胞的限制和修饰作用)宿主细胞的限制和修饰作用：两种不同来源的入-噬菌体 入K；入B，能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（ K株 ，B 株 ）。当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。一但 入K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入K 后代，能感染 B 株, 不能感染原来 K株.1 宿主细胞的限制和修饰作用；1两种不同来源的入-噬菌体 （ 入- K ，入-B ）。2能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（ K株 ，B 株 ）。3当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时， （ 入K-B ，入B-K ）感染下降数千倍。4一但 入K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入-K 后代，能感染

3、 B 株, 不能再感染原来 K株. 称为：宿主细胞的限制和修饰作用二限制和修饰作用的分子机制1大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修饰系统。1）它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM; hsdS.2）hsdR编码限制性核酸内切酶-识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点）3）hsdM编码产物是DNA甲基化酶-催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。4） hsdS表达产物的功能是-协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。 2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株 中， 1）宿主细胞甲基化酶，将染色

4、体DNA和噬菌体DNA 特异性保护. 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。-（修饰） 3当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解 -（限制） 4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程 中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 5但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记(一但 入-K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入-K 后代，能感染 B 株, 不能感染原来 K株.) 6细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外来DNA。C株不能产生限制性内切酶，其它来源入- 噬菌体可以感染C株，而在 C株

5、繁殖入- 噬菌体则在 K株和 B 株 受到严格的限制作用三 限制性内切酶的分类：（三大类）I I类， II类, III类.2 I类，III类为限制-修饰酶。 限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能 单位包含在 同一酶分子中。3 II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点 专 一，适合于DNA重组。四原核细胞中限制和修饰系统四原核细胞中限制和修饰系统 I类酶 II类酶 III类酶 酶分子 三亚基双功能 内切酶与甲基化酶分离 二亚基双 能识别位点 二分非对称序列 4-6bp序列，回文结构 5-7bp非对称序列切割位点 距识别位点1000bp 在识别位点中或靠识别位点 在识别位点 下游24

6、-26bp限制性反应 互斥 分开反应 同时竟争与甲基化反应限制作用 需要ATP 需要 需要 不需要 五I类酶，III类酶限制-修饰酶基本特怔 1）I类酶，EcoK，EcoB。（1）异源多聚体，亚基R.M.S分别具有限制,修饰酶的作用，特 异性位点识别活性。（2）I类酶与 DNA识别位点结合依赖亚基 M与辅助因子S腺苷甲硫氨酸(SAM)相互作用。（3）S腺苷甲硫氨酸(SAM)通过变构作用使酶处于活性状态，酶与 DNA识别位点结合后，根据甲基化状态发挥相应酶的活性，或限制, 或限修饰，或不限制不限修饰 2）III类限制修饰酶基本特怔（1）亚基R，MS亚基组成。MS亚基具有识别和甲基化修饰双重作用.

7、（2）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。（3）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关 MboII 识别 5-AAGA- 3 切割位点 5-GAAGANNNNNNNN/N-3 3-CTTCTNNNNNNN/NN-53）II类限制修饰酶基本特怔（1） 命名规则： 生物体属名的第一大写字母和种名前两个小写构成基本名称 基本名称 + 菌株名的字母 + 罗马字母（发现顺序） Hid III Haemophilus infuenzae d株中的第三个酶 EcoR I 基因位于Escherichia coli 抗药性R质粒上 E co R I 细菌属名 细菌种名种 菌株类型 有几种限制酶（2）特点 A识别

8、序列 4，5 或 6个碱基对， EcoR I 识别 5-G/AATTC- 3 序列 3-CTTAA/G- 5 B180度旋转对称回文结构，对称轴在第三，四碱基之间。 C任何一个DNA分子，每9对碱基出现一个II类酶切口。（3） 切割方式 A以酶切特点来分 同位酶：识别相同序列切点不同。 同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。 同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。 B以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。 粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补 DNA是分子重组的基础限制内切酶切出的三种断口 六甲基化酶的基本特征：1)类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，a)

9、限制性内切酶，甲基化酶的识别位点相同，序列内使碱基甲基化，封闭酶切口。b)甲基化酶封闭一个限制性内切酶切口同时产生另一种酶切口。 c) DNA腺嘌呤甲基化酶 Darn DNA胞嘧啶甲基化酶 Dcm七酶切图谱示意图1。 一圈表示一种酶。2单切口酶在里圈，越多切口酶越在外面。3大写英文字母表示片段（ A，B，C AB ）。4 两种片段同样大小 （ A1 A2 A3 E1 E2 E3）。几次实验后，大小不一 致以 虚线表示不肯定。八DNA切接反应的影响因素1 限制性内切酶的切割反应 10-50mmol/L Tris-HCl (PH7.5), 10mmol/L MgCl2, 1mmol/L DTT (

10、二硫苏糖醇) 只是盐浓度不同，分低盐，中盐，高盐组,1）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度相同，可同时反应。 2）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别不大，中，高 盐，可同时反应。利于酶较贵重的盐浓度缓冲液。 3）两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别大，低，高盐， 不可 同时反应。 a) 低盐组先切，加热灭活后，补加盐浓度再切。 b) 沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液 c）两种酶不能同时反应，有先有后。 图3-162酶量 标准反应37度反应1小时完全水解1微克所需的酶量。 0.11.0微克DNA 5微升 10倍缓冲液 2微升 酶 1微升（10倍过量） 无菌水 12微升 总体积 20微升 酶加入量

11、不超过总体积十分之一. 九酶切位点的确定 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N 1.片段大小2450 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N2. 两单酶切成三个片段,说明各有两个切点 -p- p- 750 500 12003 .Pst1, 1200, 750不见, 说明:(1) 另外两个酶的切点在其中 -x-p-p-x- Xbo1 500 (2) 两个Pst1酶的切点相距500 500 -1200-4. 1200-300+900(被Xbo1) -x-p-p- x- 300 900 Pst1距Xbo1为300 -750-5. 750150+600 -x-p-p-x-

12、 150 600 Pst1距Xbo1为600 -1400-6. 1400600+500+300 -x-p-p-x- 600 500 300 -2450-7. 2450-150+600+500+300+900 -x- p- p-x- 150 600 500 300 900 基因重组的其它工具酶 1 DNA连接酶 催化的基本反应形式： 图3-11 DNA双链分子上相邻 3 羟基和 5 磷酸集团共价结合， 形成 3-5 磷酸二酯键， 使原来断开的缺口重新连接起来。（1）T4 DNA连接酶 由 T4 噬菌体基因编码，分子量60KD。 基本活性: 图3-12 1）修复双链DNA上单链缺口 2）连接RNA

13、-DNA杂交双链上DNA链缺口 3）连接完全断开两个平头双链DNA分子。 修复双链 DNA上 单链缺口， 连接 RNA-DNA杂交双链上 DNA链缺口， 连接完全断开两个平头 双链DNA分子。 2聚合酶 DNA聚合酶活性 3-13 1）5-3聚合酶活性 2）3-5外切酶活性 3）5-3外切酶活性 4）核酸内切酶活性 Klenow酶 1）5-3聚合酶活性 2）3-5外切酶活性 作用： 1）修复限制性内切酶造成3凹端，成为平末端。 2）用同位素对DNA标记。 3）催化第二链合成 4）测定DNA序列 3末端脱氧核苷酰转移酶(TdT) 图3-141） 适合于带有3游离羟基的双链分子。2) DNA双链3端突出时， TdT将脱氧核苷酸聚合在二条链的3端。作用：TdT在人工粘性末端的构建极为有用。4. SI核酸酶1）降解单链DNA或RNA2）反应方式为外切和内切3）酶量大时降解双链核酸 作用：切平突出单链末端, 和发卡结构中环状。制作SI图谱 5Bal31核酸酶 图3-15 1）3端外切酶活性 2）5端外切和内切活性。 作用： 1）从双链DNA两端连续降解 2）单链DNA外切和内切 3）超螺旋结构的线