结肠癌细胞内吞活动中癌基因产物cortactin的作用

1、结肠癌细胞内吞活动中癌基因产物cortactin的作用【摘要】目的讨论癌基因es1表达产物皮层蛋白(rtatin)与结肠癌细胞内吞运动的关系。方法采用共聚焦显微镜检测人结肠癌细胞株ht29细胞内rtatin与内吞过程功能蛋白rab5及rab11的分布情况，以及rtatin和组成性内吞标记转铁蛋白(tfn)的关系。采用病毒转染的方法，将外源性全长rtatin及其突变体转入结肠癌细胞内，观察过表达皮层蛋白及其变异体对细胞内吞活动的影响。进一步采用esternblt和免疫荧光分析方法检测rtatin磷酸化与tfn内吞在时间和剂量上的关系。结果rtatin与rab5/11及tfn在ht29细胞内共定位

2、。当ht29细胞过表达皮层蛋白氨基端或羧基端缺失的突变体时，细胞的内吞活动受到削弱，而表达全长皮层蛋白或载体的对照组未受明显影响。同时发现rtatin的磷酸化与tfn内吞呈时间和剂量依赖关系。结论rtatin在结肠癌细胞ht29的内吞活动中发挥作用，其功能的发挥可能依赖其氨基端和羧基端构造区域。在内吞过程中，皮层蛋白发生磷酸化。【关键词】结肠癌皮层蛋白细胞内吞0引言结肠癌是主要的消化道恶性肿瘤，其发病率在我国逐年上升。尽管各种治疗方法在不断改进，但其预后始终不太理想。究其原因，主要是对结肠癌的浸润和转移缺乏强有力的干预。近来的研究发现，与所有的恶性肿瘤一样，在结肠癌浸润和转移过程中，侵袭性伪足

3、(invadpdia)的形成发挥了非常重要的作用1。细胞通过侵袭性伪足附着于细胞外基质并产生溶解细胞的物质打破基质屏障向周围侵袭2。细胞的内吞作用在此过程中发挥重要作用35，因此,以癌细胞内吞活动为切入点,将有助于理解癌细胞侵袭性伪足的作用过程及转移机制。然而到目前为止，有关结肠癌细胞内吞过程的机制还不清楚。有研究说明，癌基因es1的表达产物rtatin皮层蛋白对细胞内吞活动的实现起关键作用6，但该分子在结肠癌细胞内吞活动中的作用如何尚未见研究报道。本实验通过分析结肠癌细胞中皮层蛋白与癌细胞内吞的关系，发现rtatin的表达影响结肠癌细胞的内吞活动。rtatin的氨基端和羧基端对于rtatin

4、在内吞过程中发挥功能起关键作用。同时发现rtatin在结肠癌细胞的内吞过程中发生磷酸化。本文对此作首次报道。1材料和方法1.1材料1.2方法采用stata7.0软件，作方差分析，p0.05为差异有统计学意义。2结果2.1结肠癌细胞内rtatin与rab5和rab11及内吞的转铁蛋白颗粒的定位关系rab蛋白家族是调控真核细胞囊泡运输的主要蛋白质，rab5主要负责调控细胞内吞过程中胞吞泡与初级内体的交融，rab11主要定位于循环内体。我们在共聚焦显微镜下观察发现：结肠癌细胞内rtatin呈彗星尾状红色与rab5/11蛋白绿色互相关联，见图1。同样，在吞噬fit标记的tfn的结肠癌细胞内，rtati

5、n呈彗星尾状与tfn发生共定位，见图2。2.2癌细胞过表达外源性rtatin及其变异体对tfn内吞的影响rtatin分子由5个重要的功能区组成，包括氨基端的180aa区域、羧基端sh3构造域等,见图3。为进一步研究rtatin分子如何与结肠癌细胞的内吞活动发生关系，我们设计了rtatin的突变体，包括氨基端缺失(nd)、羧基端缺失(sd)突变，将全长rtatint及突变体编码dna克隆到带绿色荧光蛋白(gfp)的病毒载体gin，并转染结肠癌细胞ht29获得稳定表达重组质粒的细胞株。细胞分成四组：t组表达全长rtatin，nd组表达n端180aa缺失rtatin变异体，sd组表达端sh3缺失的r

6、tatin变异体，gin组空载体，作为对照。为观察癌细胞的内吞活动，一方面，我们将癌细胞与带红色荧光标记物的转铁蛋白发生作用，在荧光显微镜下观察癌细胞内的tfn颗粒的数量以及与rtatin的互相关系；另一方面，我们将癌细胞与生物素标记的tfn发生作用，并以elisa法检测不同细胞内吞的tfn数量，以评价细胞的内吞活动的变化情况。a:rtatin;b:reb5;:erge;d:rtatin;e:rab11;f:erge图1rtatin呈彗星尾状与rab5/11共定位于细胞浆略fig1rtatinlikeettailasbservedlalizedithrab5/11inytplasina:rta

7、tin;b:tfn5;:erge略图2彗星尾状的rtatin与fit标记的tfn共定位于细胞浆略fig2rtatinlikeettailaslalizedithtransferrinlabelledbyfitinytplas图3rtatin的分子构造示意图略fig3leularnstitutinfrtatin共聚焦显微镜观察结果显示，表达全长rtatin的结肠癌细胞内，外源性rtatin绿色，见图4a与癌细胞内吞的tfn红色，见图4a互相关联；而在表达rtatin突变体的细胞内，突变体rtatin分子和内吞的tfn不发生关联，与全长rtatin不同。elisa法检测各组细胞tfn内吞量，t组与

8、gin组细胞tfn内吞量均较多，且数量相似，差异无统计学意义(p0.05)；nd组和sd组与t和gin组相比较细胞tfn内吞量显著下降，差异有统计学意义(p0.05)，见图5。实验结果提示，rtatin的氨基端和羧基端对于rtatin在内吞过程中发挥功能起重要作用。2.3rtatin在tfn内吞过程中发生磷酸化，并呈现时间和剂量依赖关系采用esternblt方法从蛋白程度检测rtatin磷酸化与tfn内吞活动之间的关系。图6显示，随着细胞内bitfn数量的增多，rtatin磷酸化的量逐渐增多。另一方面，随着内吞活动的延长，rtatin磷酸化的量逐渐增多，细胞内吞的转铁蛋白量也逐渐增多。a:rt

9、atin(t);b:rtatin(nd);:gin;d:rtatin(sd)greenasrtatinlabelledbygfp,redasttfnlabelledbyredfluresene图4表达全长rtatin和突变rtatin的结肠癌细胞转铁蛋白(tfn)的内吞情况略fig4transferrinuptakeinellsexpressinhlertatinrutatinalrtatin*：与gin组比较p0.05,*：与gin组比较p0.05图5elisa法检测各组结肠癌细胞tfn内吞量略fig5transferrinuptakeineahgrupflnanerellsasanalyz

10、edbyelisathelevelfrtatinphsphrylatinasinreasedhentransferrinuptakeinatieanddsedependentanner图6rtatin磷酸化蛋白印迹分析结果略fig6theresultsfrtatinphsphrylatinanalyzedbyesternblt同时，我们采用免疫荧光的方法观察了癌细胞内吞活动中rtatin磷酸化的情况。图7显示，30g/ltfn处理的细胞内rtatin磷酸化程度比10g/ltfn处理细胞内的rtatin磷酸化程度增高。当没有tfn处理时，rtatin磷酸化较少,见图8。研究结果提示，rtatin

11、在结肠癌细胞内吞过程中发生磷酸化改变，rtatin的磷酸化是否为癌细胞的内吞活动必须的事件，值得进一步讨论。3讨论在恶性肿瘤的浸润和转移过程中，侵袭性伪足的形成发挥了非常重要的作用。癌细胞通过侵袭性伪足附着于细胞外基质并产生溶解细胞的物质打破基质屏障向周围侵袭。侵袭性伪足发挥作用与癌细胞的内吞活动有亲密关系。癌细胞在侵袭过程中通过内吞活动传递有关细胞内外的分子信号。因此将癌细胞的内吞活动作为研究的切入点将有利于我们认识癌细胞的侵袭过程。网格蛋白介导的细胞内吞是细胞摄取营养至胞内以及转导胞内外信号的重要途径。这一过程大致分为四个根本步骤：1配体与膜受体结合形成一个细胞膜小窝(pit);2小窝逐渐

12、向内凹陷。脱离细胞膜形成一个包被小泡;3包被小泡解聚,形成初级内体;4初级内体与溶酶体交融,吞噬的物质被溶酶体的酶水解；内体以出芽形式形成运载受体的小囊泡，返回细胞质膜710。近来研究说明，细胞的内吞过程必须有细胞内肌动蛋白(atin)聚合活动的参与，而皮层蛋白rtatin在细胞内肌动蛋白的聚合过程中发挥重要作用7，11。这些发现促发我们对rtatin在内吞过程中作用的研究设想。图7结肠癌细胞在不同数量的tfn处理后，rtatin磷酸化程度的变化略fig7thelevelfrtatinphsphrylatinashangedafterthelnanerellseretreatedithtran

13、sferrin图8对照组，无tfn处理时，rtatin磷酸化程度低下fig8ntrlgrup,ithutbeingtreatedithtransferrin,thelevelfrtatinphsphrylatinasler在肿瘤的进展过程中，癌基因及其编码蛋白发挥重要作用。皮层蛋白rtatin由癌基因es1编码，同时，rtatin也是癌基因sr的主要作用底物,rtatin在sr信号途径发挥特殊功能12。研究说明，rtatin在结肠癌细胞中表达，对癌细胞的运动发挥作用1314。我们的结果发现其存在共定位现象，rtatin表现为彗星尾状与rab5/11或tfn互相关联。rab蛋白家族是调控真核细胞

14、囊运输的主要蛋白质，属于ras相关的小gtp酶，其中rab5主要负责调控胞吞过程中胞吞泡与初级内体的交融，是早期胞吞过程中的一个重要的限速成分，rab5agdi复合体是配体可以进入有被小泡所必需的构造1516，rab11定位于循环内体上，是细胞内吞过程中内体的功能元件1718。转铁蛋白(tfn)内吞是细胞典型的内吞活动，常被用作内吞研究的模型。tfn被细胞摄取在细胞内的位置，显示细胞内吞过程的途径。rtatin与rab5/11及tfn有共定位现象，提示rtatin的活动与细胞的内吞过程有一定关系。为进一步研究rtatin在结肠癌细胞内吞中的作用，我们构建rtatin及其突变体重组质粒，用共聚焦

15、显微镜和elisa法检测细胞内吞tfn的情况。结果显示rtatin羧基或氨基端缺失的突变体表达细胞，对于tfn的内吞活动明显减少。结果提示rtatin的氨基端和羧基端对于rtatin在细胞内吞过程中发挥功能起关键性作用。由于rtatin是癌基因sr的作用底物，sr作为一种酪氨酸激酶促使rtatin磷酸化而使rtatin传递上游信号19。sr信号途径在肿瘤的侵袭过程发挥重要作用20。由此我们推想在癌细胞的内吞活动中rtatin是否存在磷酸化变化。我们通过初步试验发现答案是肯定的。我们推测rtatin可能通过其磷酸化程度来影响结肠癌细胞的内吞作用，这值得进一步研究。【参考文献】1eavera.in

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