西花蓟马的SCAR分子检测技术

1、西花蓟马的的SCARR分子检测测技术孟祥钦1，闵闵 亮1, 3，万方浩浩1, 2，周忠实1, 2，王文凯凯3，张桂芬1, 2, 基金项目：国家“973”计划项目（2009CB119200）；国家科技支撑计划项目（2006BAD08A14）；公益性行业（农业）科研专项（200803005）；国家自然科学基金项目（30971967）；中央财政国家重点实验室自主研究课题专项经费（SKL2007SR04）作者简介：孟祥钦，男，1983年12月生，河南濮阳人，硕士研究生，研究方向为入侵生物学与分子生态学，E-mail: 通讯作者Author for cCorrespondenceing author,

2、E-mail: HYPERLINK mailto:guifenzhang3 guifenzhang3收稿日期Received：2009-11-25；接受日期Accepted：2010-01-31(1. 中中国农业科科学院植物物保护研究究所，植物物病虫害生生物学国家家重点实验验室，北京京1001993；2. 农业业部外来入入侵生物预预防与控制制研究中心心，北京11000881；3. 长江大大学农学院，湖北北荆州 43340255)摘要：西花花蓟马Frrankllinieella occiidenttaliss (Perggandee)是一种世世界性入侵侵害虫，寄寄主范围广广，危害严严重，2003

3、3年首次在在我国发生生危害，并并有进一步步扩散蔓延延的趋势。针对蓟马马类害虫虫虫体微小、形态相似似，难以准准确快速区区分的问题题，采用特征序序列扩增区区域（SCCAR）标记技术术，以西花花蓟马及与与之同域发发生的其他他种类蓟马为对象象，筛选出出1对西花蓟蓟马特异性性引物（FOMF/FOOMR），其扩增片段大大小为3220 bp。种特异性性检测结果果显示，该该对引物只只对西花蓟蓟马的基因因组DNAA具有扩增增能力，对对同域发生生的花蓟马马F. inttonsaa (Trybbom)、禾花蓟马F. tennuicoorniss (Uzell)、烟蓟马马Thriips ttabacci L.等41种

4、蓟马马不具有扩扩增效果。该对引物物不仅对不不同虫态的的西花蓟马马具有扩增增能力，而而且在西花花蓟马发生生地的寄主主植物组织织内亦检测到了其卵的存在在。同时，该检检测技术灵灵敏度高，对对成虫的最低检出出阈值为1/1600头。本检测测技术在口口岸检疫以以及花卉、蔬菜和种种苗调运中中的害虫检检测和监测测中具有重重要意义。关键词：西西花蓟马；RAPDD-PCRR；SCAAR；快速速检测；特特异扩增；检出阈值值中图分类号号: QQ966 文献标识识码: AA 文章编号号: 04554-62296(22010)03-00000-000SCAR markker ffor rrapidd ideentiffi

5、cattion of tthe wwesteern ffloweer thhripss, Frannklinniellla occcidenntalis (Perggandee) (Thhysannopteera: Thriipidaae)MENG Xianng-Qiin1, MINN Liaang1,3, WANN Fanng-Haao1,22, ZHOOU Zhhong-Shi11,2, WANGG Wenn-Kaii3, ZHAANG GGui-FFen1,2,* (1. Staate KKey LLaborratorry foor Biiologgy off Plaant DDisea

6、ases and Inseect PPestss, Innstittute of PPlantt Prootecttion, Chiinesee Acaddemy of Agriicultturall Sciiencees, BBeijiing 11001993, Chiina; 2. CCenteer foor Maanageementt of Invaasivee Aliien SSpeciies, Miniistryy of Agriicultture, Beijjing 1000081, Chinna; 33. Agriicultture Colllege, Yanggtze Univ

7、versiity, Jinggzhouu, Huubei 4340025, Chinna)Abstrract: Thee wessternn floower thirrps, Frannklinniellla occcideentallis (Perggandee), iss a wworlddwidee pesst, ccausiing sserioous ddamagge too a wwide rangge off hosst pllantss. Itt wass firrst rreporrted in CChinaa in 20033, wiith aa treend oof fuu

8、rtheer sppreadding. Mosst off thrrips speccies are smalll inn sizze annd siimilaar inn morrphollogy, whiich mmakess it hardd to be diistinnguisshed quuicklly. IIn thhe prresennt reesearrch, a paair oof SCCAR (sequeence charaacterrizedd ampliifiedd regioons) primmers (FOMMF/FOOMR) wwhichh aree speeci

9、fiic too wessternn floower thriips wwas ddevellopedd by usinng otther ninee fammiliaar thhripss speeciess as the conttrol. The frragmeent aampliifiedd by the primmers FOMFF/FOMMR was 320 bbp inn lenngth. Speccificcity testts peerforrmed withh thiis paair oof prrimerrs shhowedd thaat alll F. occciden

10、ntaliis sppecimmens weree dettecteed poositiively and no ccrosss reaactioons wwith otheer 411 thrrips speeciess, inccludiing FF. inttonsaa (Trybbom), F. tennuicoorniss (Uzell) andd Thrrips tabaaci LL., wwere deteectedd. The methhod wwas ttesteed onn a ssinglle maale aand ffemalle addult, a ssinglle

11、prre-puupa aand ppupa, a ssinglle fiirst11st- andd or secoond2nd- stagge insttar larvva,e andd eveen a singgle eegg, and provved tto bee appplicaable for thesse sttagess of F. oocciddentaalis. Morreoveer, tthe 3320 bbp geenomiic DNNA frragmeent wwas cclearrly iidenttifieed inn thee hosst pllant tiss

12、sues colllecteed inn F. occiidenttaliss inffesteed arreas. Wheen thhe diilutiion wwas 11/1600 of a whhole femaale aadultt of F. oocciddentaalis, thee 3200 bp DNA fraggmentt couuld bbe iddentiifiedd forr alll repplicaates. Ourr preesentt ressultss inddicatte thhat tthe ttechnniquee is ussefull in qua

13、rrantiine aat poorts and in ppest deteectioon annd moonitooringg duriing traanspoortattion of ffloweers, vegeetablles aand sseedllingss.Key wwordss: Frrankllinieella occiidenttaliss; RAAPD-PPCR; SCARR marrker; rappid ddetecctionn; speecifiic ammplifficattion; dettectaable threesholld liimit valuue西花

14、蓟马FFrankkliniiellaa occcidenntaliis (Perggandee)是缨翅目目(Thyssanoppteraa)蓟马科(Thrippidaee)花蓟马属属的一种重重要害虫，自20世纪纪40年代代即对美国西西部的花卉卉产业造成巨巨大的危害害(Bailley, 19400)，近30年年来，随着国际贸易易活动的日日益频繁，西西花蓟马迅迅速传播扩散，已已成为世界界性入侵害害虫(Kirkk andd Terrry, 20033)。我国于20000年首次在昆明明国际花卉卉节参展的的缅甸盆景景上截获西西花蓟马(蒋小龙等等, 20001)，20033年在北京京温室的辣椒上发发现其为

15、害(张张友军等, 20003)，随随后在云南南(徐家菊菊和韦丽莉, 20055)、山东东(郑长英英等, 22007)等地亦发现现其为害。程俊峰等等(20006)采用用CLIMMEX软件件，结合我我国6344个气象站站点的数据据，对西花花蓟马在我我国的潜在在适生区进进行了预测，结果果显示，西花蓟马马在我国具具有广泛的的适生区。即使在非适生区，随随着温室、大棚等设设施农业的的快速发展，西花花蓟马的发发生也会成为可可能。西花蓟马的的寄主范围围十分广泛泛，包括菊菊科、葫芦芦科、茄科科、豆科、十字花科科等在内的的62科，5000多种植物，基基本涉及所所有的开花花植物(Yudiin et aal., 19

16、986; Morritz, 20002)。西花蓟马马的为害方式主主要有两种种：一是以锉吸式式口器直接接取食为害害，降低产量量，使花卉卉丧失观赏赏价值；此此外，成虫虫将卵产在植物组织织中或果实实表面影响响果实的品品质(Roobb and Parrrellaa, 19989; Cockkfielld et aal., 20077)；二是传播植植物病毒，如如菊花茎坏坏死病毒(chryssanthhemumm steem neecrossis vviruss, CSSNV) (Bezzzaraa et al., 19999)、花生环斑斑病毒(grounndnutt rinngspoot viirus,

17、 GRSSV) (Wijjkampp et al., 19955)、凤仙斑点点坏死病毒毒(impattienss neccrotiic sppot vviruss, INSV) (Dee Angeelis et aal., 19933; Wiijkammp and PPeterrs, 11993)、烟草条纹纹病毒(tomatto chhlorootic spott virrus, TCSVV) (Wiijkammp ett al., 19955) 和番茄斑萎萎病毒(tomatto sppotteed wiilt vviruss, TSSWV) (Gaardenner eet all., 119

18、35)等，使病毒病病大流行，造造成植物严重减减产甚至绝绝收(Jonees, 22005)。西花蓟马体体型微小，成虫体长11.01.5 mm，并且与其他蓟马马种类形态态十分相似。而以往常常用的形态态学特征识识别法只能能用于成虫虫的鉴定，对对蛹、幼虫和卵则无能为为力，对于不完完整的蓟马马标本，根本无法法根据形态态学特征进进行鉴别，因此寻寻找快速准准确的西花花蓟马鉴定定技术是有有效阻断其其进一步扩扩散蔓延的的必要前提提。近年来分分子生物学学技术发展展迅速，利用分子标标记技术只只需要少量量的DNAA就可以快快速准确地地的鉴定出蓟马马种类，该类技术不仅可可以检测成成虫，对成成虫前的各各个虫态亦亦具有同样

19、样的检测效效能，目前前已应用于西花蓟马马的鉴定研究(Moriitz et aal., 20000; Brunnner et aal., 20022; Todaa and Komaazakii, 20002; 游游中华等, 20007; 周力兵等, 20007)。特征序列列扩增区域域(sequeence charaacterrizedd ampliifiedd regioons, SCARR)标记技术术是通过随机扩扩增多态性性DNA (randoom ampliifiedd polymmorphhic DDNA, RAPDD)技术筛选选出靶标种种特异片段段，然后将目标标 RAPDD 片段进进行克

20、隆和和测序，并并根据此目目标片段两两端的碱基基序列设计计特异性引物；然后后以该对特特异性引物物对基因组 DNAA 片段再再次进行PCRR扩增，进而而将与原RAPPD片段相相对应的单单一位点鉴鉴别出来；SCARR标记为共显性遗遗传，待检检 DNAA 间的差差异可直接接通过有无无扩增产物物来显示(黎裕等, 19999)。与通常采采用的限制制片段长度度多态性(restrrictiion ffragmment lengtth polymmorphhism, RFLLP)、碱基序序列测定等等方法相比比，SCAAR标记技技术免去了了筛选限制制性内切酶酶和碱基序序列测定的过程，不仅结果果稳定、灵灵敏度高、重

21、复性能能好，而且操作简便、成本低低，特异性引物一旦获获得，即可用于大规模模检测分析析。 本本研究围绕绕西花蓟马马易随蔬菜菜、花卉及苗木木等的调运运而传播蔓蔓延，对农业生生产造成严严重威胁，却难以进行快速准确鉴定的的科学问题题，采用SCAAR标记技技术，从检测和和监测的角角度，研究究其快速分分子检测技技术，并以与西花蓟马马同域发生生的花蓟马马、禾花蓟马等其他他蓟马种类类为对象进行SSCAR标标记的种特异性性检验，以梯度稀稀释的单头头成虫DNNA和不同同虫态的DDNA为模模板进行灵灵敏性检验验，并同时对西花花蓟马发生生地的寄主主植物组织织进行了检检测分析。该研究结果果为西花蓟蓟马快速检检测体系的的

22、构建提供供了依据，为为有效阻截西花蓟马马在我国的的进一步扩扩散蔓延和和危害提供供了技术保保障。1 材料与与方法1.1 供供试虫源西花蓟马种种群以市售扁豆饲养于于中国农业业科学院植植物保护研究所南南区养虫室室，国内发生生的其他种类的蓟马均采自自田间，具具体采集信信息如表1所示。其中，西西花蓟马由由蓟马系统统分类学专专家LA Mounnd教授(CSIRRO Enntomoologyy, Auustraalia)鉴定确认认；其他种种类的蓟马马由闵亮同同学经过蓟马形态态学鉴定技技能培训(主讲专家家：华南农农业大学资资源环境学学院张维球球教授和童晓立教授授)后依据据相关资料料(韩运发, 19977; 张

23、维维球等, 19999; Mooritzz et al., 20004)鉴定定确认。表 1 用于SCCAR引物物种特异性性检验的蓟蓟马种类Tablee 1 TThripps sppeciees ussed ffor sspeciies sspeciific testt of SCARR priimer编号No.种类Speeciess寄主Hosst pllant采集地点CColleectioon loocaliity采集时间CColleectinng daate蓟马科Thhripiidae2花蓟马Frrankllinieella intoonsa (Trybbom)月季Chiinesee ros

24、se北京昌平CChanggpingg, Beeijinng2008.103禾花蓟马FF. tennuicoorniss (Uzel)豌豆花Peea甘肃酒泉JJiuquuan, Ganssu2008.084八节黄蓟马马Thripps flavvidullus (Bagnnall)月季Chiinesee rosse北京昌平CChanggpingg, Beeijinng2008.105黄胸蓟马TT. haawaiiiensiis (Morggan)非洲菊Geerberra北京海淀HHaidiian, Beijjing2008.086烟蓟马（葱葱蓟马）T. tabbaci Linddemann万寿菊M

25、aarigoold北京海淀HHaidiian, Beijjing2008.097色蓟马T. collorattus SSchmuutz杂草HC-3 wWeed HC-33新疆伊犁YYili, Xinnjianng2008.07.8葱韭蓟马TT. alllioruum (PPriessner)葱Scalllionn北京密云MMiyunn, Beeijinng2008.069黄蓟马T. flaavus Schrrank苦瓜Bittter gourrd广西南宁NNanniing, Guanngxi2008.0510杜鹃蓟马TT. anddrewssi (Bagnnall)茶花Cammelliia湖南

26、长沙CChanggsha, Hunnan2008.0311棕榈蓟马TT. palmmi Kaarny芒果Mmaango广西南宁NNanniing, Guanngxi2008.0512普通蓟马TT. vullgatiissimmus HHalidday小叶女贞LLigusstrumm quiihouii福建福州FFuzhoou, FFujiaan2007.1213喜马拉雅蓟蓟马T. himaalayaanus (Peliikan)杂草wWeeed西藏扎囊县县Zhannang, Tibbet2008.0714带蓟马属TTaeniiothrrips sp. Amyoot ett Serrvillle

27、蜘蛛兰Sppiderr orcchid广东广州GGuanggzhouu, Guuangddong2007.0715菊花蓟马MMicroocephhalotthripps abbdomiinaliis (Craawforrd)非洲菊Geerberra北京海淀HHaidiian, Beijjing2008.0818塔六点蓟马马Scollothrrips takaahashhii PPriessner桃树Peaach北京海淀HHaidiian, Beijjing2007.1019普通大蓟马马Megallurotthripps ussitattus (Bagnnall)丝瓜Looofah湖南长沙CCh

28、anggsha, Hunnan2008.0920丝大蓟马MMeg. ssjosttadtii Tryybom空心菜Waater spinnach湖北武汉WWuhann, Huubei2008.1021端大蓟马MMeg. disttaliss (Karnny)葱Scalllionn湖南长沙CChanggsha, Hunnan2008.0322苏丹呆蓟马马Anapphothhripss suddunennsis Trybbom葱Scalllionn福建福州FFuzhoou, FFujiaan2007.1223芒缺翅蓟马马Aptiinothhripss styylifeer Trrybomm杂草YL

29、-1 wWeed YL-11新疆伊犁YYili, Xinnjianng2008.0724茶黄硬蓟马马Scirrtothhripss dorrsaliis Hoood女贞Wiggustrrum 北京海淀HHaidiian, Beijjing2008.0525袖指蓟马CChiroothriips mmaniccatuss (Haliiday)铁菠萝花IIron pineeapplle fllowerr湖北武汉WWuhann, Huubei2008.1026齿裂绢蓟马马Hydaatothhripss denntatuus (Steeinweeden et MMoultton)大豆Soyybeann湖

30、北荆州JJingzzhou, Hubbei2008.0527伪棍蓟马属属Pseuudodeendroothriips ssp. SSchmuutz灰绿藻Grray ggreenn alggae河北承德CChenggde, Hebeei2008.0728阳针蓟马属属Heliiothrrips sp. Haliiday甘薯Sweeet ppotatto湖南长沙CChanggsha, Hunnan2008.0929红带滑胸针针蓟马Seelenoothriips rrubroocincctus (Giarrd)红槭木Reed maaple湖南长沙CChanggsha, Hunnan2008.09纹蓟马

31、科AAeoloothriipidaae30横纹蓟马AAeoloothriips ffasciiatuss (Linnnaeuss)玉米Corrn北京密云MMiyunn, Beeijinng2008.0731新疆纹蓟马马Aeo. xinnjianngenssis HHan三叶草Clloverr新疆乌鲁木木齐Urumqqi, XXinjiiang2008.0734间纹蓟马 Aeo. inttermeediuss Baggnalll茼蒿菊Shhrubbby Argyyrantthemuum甘肃酒泉JJiuquuan, Ganssu2008.0835西藏纹蓟马马 Aeoo. xiizanggensii

32、s Haan杂草Wweeeds西藏扎囊县县Zhannang, Tibbet2008.0736白腰纹蓟马马Aeo. albbicinnctuss Hallidayy小白菊花CChryssanthhemumm甘肃酒泉JJiuquuan, Ganssu2008.0837基白黑蓟马马Melaanthrrips palllidioor Prriesnner蚕豆Horrsebeean重庆北碚BBeibeei, CChonggqingg2008.03管蓟马科PPhlaeeothrripiddae38稻简管蓟马马Hapllothrrips aculleatuus (FFabriiciuss)芥蓝Cabbbag

33、ee musstardd北京顺义SShunyyi, BBeijiing2008.0739华简管蓟马马H. cchineensiss Priiesneer长鬃蓼Kooreann perrsicaary湖北武汉WWuhann, Huubei2008.1040含羞简管蓟蓟马H. leuucantthemii (Scchrannk)长鬃蓼Kooreann perrsicaary湖北武汉WWuhann, Huubei2008.1041菊简管蓟马马H. ggowdeeyi (Frannklinn)菊花Chrrysannthemmum甘肃酒泉JJiuquuan, Ganssu2008.0942简管蓟马属属H

34、apllothrrips sp. Amyoot ett Serrvillle玉米Corrn北京密云MMiyunn, Beeijinng2008.0743榕母管蓟马马Gynaaikotthripps fiicoruum (Marcchal)榕树Bannyan广西南宁NNanniing, Guanngxi2007.1044榕端宽管蓟蓟马Mesotthripps joordanni Ziimmerrmannn榕树Bannyan福建福州FFuzhoou, FFujiaan2007.0545棒管蓟马属属Bacttrothhripss sp. Karrny油菜Rappe甘肃酒泉JJiuquuan, Gan

35、ssu2008.0946眼管蓟马属属Ophtthalmmothrrips sp. Hoodd黄槐花Yeelloww neccklaccepodd重庆云阳YYunyaang, Chonngqinng2008.061.2 基基因组DNNA的提取蓟马类昆虫虫基因组DNNA的提取取参照周志湘湘等(20077)的方法并稍稍加改进。将单头西花蓟马马/其他种种类蓟马置置于滴有 20 L提取缓缓冲液 (50 mmoll/L Trris-HHCl, l mmoll/L EDDTA, 1% SDSS, 20 mmoll/L NaCll, pHH 8.00)的paarafiilm膜上上, 以PCR管管底部作为为匀浆

36、器充充分研磨，匀浆液移入1.5 mL离心管；然后以200 L缓冲液分2次冲洗匀浆器、合并混匀；加入 5 L蛋白酶 K (20 mg/mL)，充分混匀后于 60 C 水浴 1 h (中途混匀1次)；加入 220 L 氯仿/异戊醇 (V:V=24:1)，轻柔混匀后，冰浴30 min；然后 4 C 12 000 r/min 离心 10 min，取上清液，加入 440 L预冷无水乙醇，轻柔混匀后于 -30 C放置 30 min；4 C 12 000 r/min 离心 15 min，小心弃去上清液。加入 500 L 预冷 75% 乙醇洗涤，4 C 12 000 r/min 离心 15 min，小心弃去上

37、清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥 20 min。每管加入 20 L 超纯水，充分溶解后于 -30 C 保存备用。1.3 RRAPD扩扩增与检测测根据本实验验室以往的的经验和电泳泳谱带的多态性性程度，选取取适宜的随机机引物 6 条：H9、，F12、，H16 (De Barrro annd Drivver, 19977)、，C08 (Calllejaas ett al., 20055)、，OPD008、，OPD033 (Patrra et aal., 2008)。然后分别采采用上述6 条条随机引物物(上海生工工生物工程程技术有限限公司协助助合成)，以西花蓟马马以及其他他 9 种(即花蓟

38、马 F. inttonsaa、禾花蓟马马 F. tennuicoorniss、烟蓟马马 T. tabaaci、葱葱韭蓟马 T. alllioruum、黄胸蓟马马 T. hhawaiiienssis、八节黄蓟蓟马 T. flavvidullus、豆豆大蓟马 Megaaluroothriips uusitaatus、茶黄硬蓟蓟马 Scirrtothhripss dorrsaliis 和稻简管蓟蓟马 Hapllothripss acuuleattus)田间常见蓟马种类的的DNA为模板，进行PCCR扩增。反应体系系为 20 L，其中中超纯水113.4 L、110 bufffer 2.0 L、dNTPP

39、 (10 mmoll/L) 00.4 L、TTaq 聚聚合酶 (5 U/L) 0.2 L、随机机引物 (20 ng/L) 2.0 L、模模板DNAA 2.00 L。扩扩增程序为为：94 C预变性 5 min；45个循循环：944 C 1 min、36 C 1 min、72 C 6 min；最后 72 C 延伸 6 min。扩增反应应在 ABBI-97700 PCR基因因扩增仪上上运行。取 6 L PCCR扩增产产物在1.5% (重量)琼脂糖(Amreesco)凝胶上以 80 V 电泳分离离50 mmin，然后以 GelDDoc UUniveersall Hoood III 型凝胶成成像系统(B

40、io-Rad Labooratooriess)分析电泳结果。1.4 特特征序列扩扩增区域(SCARR)标记分析析将RAPDD-PCRR扩增产物物中西花蓟蓟马特有的片段进行行切胶回收收DNA (Omega)，连接、转转化、克隆隆、测序，根据据测序结果果设计西花花蓟马特征征片段扩增增引物1对；然后，根据所扩扩增的目的的片段检验验 SCAAR 引物物的特异性性。PCR反应应体系为 20 L，其中中超纯水 11.44 L、110 bufffer 22.0 L、ddNTP (10 mmoll/L) 00.4 L、TTaq聚合合酶 (5 U/L) 0.2 L、上上游引物和和下游引物物 (20 ng/L)

41、各2.00 L、模模板DNAA 2.00 L。扩增程序序为：944 C 预变性 2 min；35个循循环：944C 25 s、，56 C 25 ss、，72 C 45 ss；最后 72 C 延伸 5 min。扩增产物物的检测方方法同1.3。1.5 西西花蓟马 SCARR引物的种种特异性及及灵敏性检检验分别以田间间采集的分属3科21属的41种蓟马(表1)的DNAA为模板，以西花蓟蓟马为阳性性对照，检检验西花蓟蓟马SCAAR引物 FOMF/FOOMR 的种特异异性。同时时，以不同同性别及虫态(雌性成虫虫和雄性成成虫；单粒卵，单头一1龄幼虫、二2龄幼虫、预蛹、蛹)的西花蓟蓟马DNAA以及梯度稀稀释(

42、1/10、，1/20、，1/40、，1/80、，1/160、，1/320、，1/640、，1/1 280、，1/2 560、，1/5 120头成虫）的单头雌雌性成虫DNAA为模板，进行灵敏性性检验，每虫态、每梯度分分别测定10头。1.6 西西花蓟马发发生地的寄寄主植物检检测西花蓟马发发生地的寄寄主植物采采集于北京京世界花卉卉大观园，种类有满天星、石竹、四季海棠、蜘蛛兰、冬瓜、黄瓜等。其中冬瓜的检测部位为叶片，其余均为处于开花盛期的鲜花花瓣。称取上述西花蓟马发生地寄主植物的叶片或花瓣各0.5 g，以40 L提取缓冲液进行匀浆，其他步骤同1.2；PCR扩增和检测方法同1.4。2 结果与与分析2.1

43、 PPCR随机机扩增及SSCAR标标记分析以西花蓟马马以及田间常见的的其他9种蓟马的DDNA为模模板，以6条随机引引物分别进行扩扩图1 随机引物OPD08对西花蓟马及9种田间常见蓟马扩增结果电泳检测图Fig.1 RAPD profiles of Frankliniella occidentalis and other nine familiar thrips species using random primer OPD08M: DNA分子量标准DNA ladder marker; 1: 西花蓟马F. occidentalis(Pergande); 2: 花蓟马F. intonsa (Tryb

44、om); 3: 禾花蓟马F. tenuicornis (Uzel); 4: 烟蓟马Thrips tabaci Lindeman; 5: 葱韭蓟马T. alliorum (Priesner); 6: 黄胸蓟马T. hawaiiensis (Morgan); 7: 八节黄蓟马T. flavidulus (Bagnall); 8: 豆大蓟马Megalurothrips usitatus (Bagnall); 9: 茶黄硬蓟马Scirtothrips dorsalis Hood; 10: 稻简管蓟马Haplothrips aculeatus (Fabricius). 箭头所示为西花蓟马的特异性条带.

45、The arrow indicates the specific fragment of the western flower thrips.M12 3 4 5 6 7 8 9 10bp2 0001 000750500250100增。电泳检检测结果显示，随随机引物OPDD08 (GTGTGGCCCCCA)的特特异性较强强、电泳谱谱带多态性性高(图1)，能扩增出一一条西花蓟蓟马特有的的条带(图图1中箭头头所示)。将该特异异条带切胶胶、回收纯纯化，并对对纯化产物物进行电泳泳检测。然然后将回收收产物与ppGEM-T Eaasy载体体连接，连连接产物转转化Topp10大肠肠杆菌感受受态细胞 (天根生化

46、科技(北京)有有限公司)；通过蓝白白斑筛选，挑取白斑斑菌落过夜夜培养后，进进行PCRR鉴定；然然后将分子子量大小与与预期一致致的阳性菌菌落送上海海英骏生物物技术有限限公司进行行测序。测序结果果表明该片片段长 569 bp，GenBBank登登录号为GGU0455557，为基因组组DNA中中的随机克克隆片段。根据测序序结果设计计SCARR引物1对对：FOMF/FOOMR，上游引物物碱基序列列为：5 -GAAAAC TACTTA TTGTTT TGTGGA GCTGG -3，下游引物物碱基序列列为：5- AAGGAA ACTAAA CGTGGA AGGAAT ACTCC -3。引物由上海生生工生物

47、工工程技术服服务有限公公司协助合合成，其扩增片片段大小为为 3200 bp。2.2 西西花蓟马 SCARR引物的种种特异性及及灵敏性检检验以西花蓟马马及田间采集的的其他41种蓟马的DDNA为模板，以所设计计的特异性性引物FOOMF/FOOMR进行PCCR扩增，电泳检测测结果显示示(图2)，该引物只对西花蓟蓟马具有扩增效果，对其他种类的的蓟马不具具有扩增能能力，表明明该引物为为西花蓟马马的特异性引引物。图2 SCAR 引物 FOMF/FOMR种特异性检验Fig. 2 Amplification pattern of genomic DNA using SCAR primers FOMF/FOMR

48、M: DNA分子量标准DNA ladder marker; 泳道1, 16, 17, 32, 33, 47: 西花蓟马Frankliniella occidentalis; 2-15, 18-31, 34-46: 其他种类蓟马，编号顺序与表1同 Other thrips species, numbered in the same order as in the Table 1.2 0001 0007505002501002 0001 000750500250100M10987654321bpM111213141516bp2 0001 0007505002501002 0001 00075050

49、0250100M474645444342bpM414039383736353433bp2 0001 0007505002501002 0001 000750500250100M282930313217bpM27262524232221201918bp以不同性别别和不同虫虫态的西花花蓟马DNNA为模板板，以SCCAR引物物FOMF/FOOMR进行PCCR扩增，检检测结果显显示，不同性别别、不同虫虫态的西花花蓟马(图图3：A)均能稳定定地扩增出 3320 bbp 的特异性性片段。当将单头雌雌性成虫的的DNA模模板进行梯度稀释至1/160头时，所有个体体均可扩增出特异异性的靶标标片段；当稀释为11/

50、320头成虫时，80%的个体条带清清晰；当稀稀释为1/1 280头成虫时，尚有20%的个体可以扩增出微弱的靶标标片段(图3：B)。表明，该对引物灵敏敏性较高，其最低检检出阈值为为1/1660头成虫虫。图3 SCAR引物FOMF/FOMR对西花蓟马DNA模板灵敏性检测电泳图Fig. 3 Amplification pattern of Frankliniella occidentalis DNA using SCAR primers FOMF/FOMR.A: 不同虫态和性别Different developmental stages and sexes. M: DNA分子量标准DNA ladde

51、r marker; 1: 单粒卵One egg; 2: 1龄幼虫First 1st instar larva; 3: 2龄幼虫Second 2nd instar larva; 4: 预蛹Pre-pupa; 5: 蛹Pupa; 6: 雌性成虫Female adult; 7: 雄性成虫Male adult. B: 不同模板稀释倍数Different dilutions. M: DNA分子量标准DNA ladder maker; 1-10：分别为 110、，120、，140、，180、，1160、，1320，1 640、，1/1 280、，1/2 560、和1/5 120头雌性成虫DNA . Lan

52、es 1-10 were dDilutions 110, 120, 140, 180, 1160, 1320 1 640, 1/1 280, 1/2 560 and 1/5 120 DNA of a whole female adult of F. occidentalis, respectively.M12345672 0001 000750500250100AM123456789102 0001 000750500250100B2.3 西西花蓟马发发生地寄主主植物组织织的检测以西花蓟马马发生地的的寄主植物物组织DNNA为模板板，以SCCAR引物物FOMF/FOOMR进行PCRR M1234

53、567bp2 0001 000750500250100图4 SCAR引物FOMF/FOMR对西花蓟马发生地寄主植物组织检测电泳图Fig. 4 Amplification pattern of host plant tissues collected from Frankliniella occidentalis infested fields using SCAR primers FOMF/FOMR.M: DNA分子量标准DNA ladder marker; 泳道1-6为：采自西花蓟马发生区的植物组织Lanes 1-6 are pPlant tissues collected from F.

54、occidentalis infested fields;. 1: 满天星花瓣Flowers of babys breath,; 2: 冬瓜叶片Leaves of wax gourd,; 3: 石竹花瓣Flowers of dianthus, 4: 四季海棠花瓣Flowers of bedding begonia,; 5: 蜘蛛兰花瓣Flowers of spider orchid,; 6: 黄瓜花瓣Flowers of cucumber; 泳道7: 西花蓟马未发生区的黄瓜花瓣Cucumber flowers collected from F. occidentalis un-infested

55、 fields as the negative control.扩增，检测测结果表明明，在冬瓜瓜的叶片以以及满天星星、石竹、四季海棠棠、蜘蛛兰兰和黄瓜的花花瓣中均扩扩增出了靶靶标片段，且且条带清晰晰(图4)，表明该该技术体系系对带有虫虫卵的寄主主植物组织织亦具有同同样的检测测效果。3 讨论西花蓟马寄寄主范围广广泛，以锉锉吸式口器器直接取食食为害，不仅仅使园林花卉卉植物失去观赏价价值，严重重影响果树、蔬菜的产量量和质量，还可传播多种植物病病毒，使病毒病大发发生，增加加生产成本本，造成严严重减产，甚至绝绝收。西花蓟马马体型微小小，雄性成成虫体长1.0 mmm左右，雌性性成虫体长长1.31.5 mm

56、，而且与其他常见的蓟马种类类如花蓟马马、禾花蓟蓟马、烟蓟蓟马等形态态相似；并且，成虫常将将卵产在寄寄主植物组组织中，而而预蛹期和蛹期主要要在土壤中中度过。鉴于目前西西花蓟马仅仅在我国局局部地区发发生危害(张友军等等, 20003; 徐家菊和韦丽莉, 20055; 郑长英英等, 22007)，并且具有有进一步扩扩散蔓延的的趋势，因因此西花蓟蓟马的快速速准确鉴定定是有效阻止其进一步扩张张、保障农农业生产安安全和生态态安全的必要前提提，而以往传传统的比较较形态学鉴鉴定方法对对于广大非非蓟马分类类学人员而言难难以满足快速鉴鉴定和有效效阻断的需求。本研究采采用的SCCAR分子子标记技术术特异性强强，可以

57、将将西花蓟马马与我国常见见的41种种其他种类的的蓟马区分开。此外，该该技术灵敏敏度高，不仅可以以检测西花花蓟马的单单头成虫、幼虫、预预蛹及蛹，还还可检测单单粒卵；当当以梯度稀稀释的单头头雌性成虫虫的DNA为为模板进行行PCR扩扩增时，其其最低检出出阈值为1/160头。而更为有有价值的是是，该技术还可以快速准确地地检测西花蓟蓟马发生地地的寄主植植物是否带有卵，表明明，该SCCAR标记记技术完全全可以用于口岸岸及蔬菜、花卉、种种苗调运中中西花蓟马马的检测及其其扩散趋势势监测。近年来，已已有多种分分子标记技技术用于蓟蓟马种类鉴定。如Moriitz (20000)采用转转录间隔区区(interrnal

58、 transscribbed spaceer, IITS)-限制片段段长度多态态性(ITS-RFLPP)的方法，先行扩增出西花花蓟马和美美棘蓟马 Echiinothhripss ameericaanus Morggan的ITS-1和ITTS-2片段，然后选用 5 种内切切酶消化两种蓟蓟马的ITTS片段，以以产生不同的带型；此方方法可以成成功地将两两种蓟马区区分开，但但是无法将西花花蓟马与其他种类的蓟马马区分开。Brunnner等等(20002)根据据线粒体DDNA细胞胞色素氧化化酶亚基I (mitoochonndriaa cyttochrrome oxiddase subuunit I, mt

59、DDNA CCOI) 433 bp 的扩增产产物，结合合测序和扩增产物物RFLPP分析，构建系统统发育树，有效区分了西花蓟马、烟蓟马和棕榈蓟马等。Toda and 和Komazaki (2002)采用ITS-2-RFLP法鉴别日本果树上常见的 9 种蓟马的成虫和幼虫，此法将PCR和RFLP相结合，比形态学鉴定更加快速、准确，而且结果可靠；但是酶切条件要求严格，并且很难找到合适的酶将西花蓟马与其他大部分种类的蓟马区分开。周力兵等(2007)利用Bruner等(2002)设计的简并引物 mtD-7.2F 和 mtD-9.2R扩增出了 6 种蓟马的 mtDNA COI 基因片段(450 bp)，然后

60、针对西花蓟马片段设计了特异性引物F.OL1/F.OR 和 F.OL2/F.OR，该两对引物可以将西花蓟马的成虫、幼虫、蛹与其他5种蓟马区分开；同时，此法避免了对PCR产物进行RFLP的过程，且结果可靠，明确易读；然而，实际检测中所涉及的蓟马种类较多，因此引物的特异性尚待进一步验证。游中华等(2007)采用PCR产物直接测序法对包括西花蓟马在内的9种蓟马的COI基因片段(433 bp)进行序列分析，可以准确地检测各虫态的西花蓟马；但是，由于需要对扩增产物进行测序，成本较高且费时，因此难以满足高通量快速检测的需求。本研究中采用SCAR标记技术获得了对西花蓟马具有特异扩增效果的引物1对，该对引物不仅