家蝇抗菌肽分子结构及抗菌谱研究

1、家蝇抗菌肽分子布局及抗菌谱研究周义文申萍涂植光尹一兵陈辉孟江萍王小中陈如山卢亮陈正庚【关键词】家蝇抗菌肽；抗菌谱；分子布局；氨基酸测序KEYRDSusadestiaantibaterialpeptide;Antibaterialspetra;leularstruturefantibaterialpeptide;Ainaidsequening抗生素的普及应用，耐药菌株和多重耐药菌株日益增长，临床抗熏染治疗已面对严肃挑衅，探求广谱高效的抗细菌、抗病毒药物，仍旧是一个非常困难的使命。抗菌肽(antibaterialpeptides)有非特异性地抗细菌、真菌、病毒等病原体作用，还大概具有抗肿瘤细胞的作

2、用1，2，是一类具有生长潜力的新型药物。蝇生长在腐物、粪便和垃圾等含有大量细菌的恶劣情况中，其自身却不会由于熏抱病原菌而引起殒命，这说明蝇应该对病原微生物有强盛的免疫力。对家蝇资源的使用外洋已投巨资作为高科技财产举行开拓，我国还处在起步阶段。本研究从家蝇幼虫体内分散到了一种广谱抗菌活性肽，并测定了其抗菌谱和部门氨基酸序列，现报道如下。1质料和要领1.1菌株和家蝇(1)尺度菌株大肠埃希菌AT25922、铜绿假单胞菌AT27853和金葡菌AT25923购自卫生部临床查验中央。(2)临床分散菌株铜绿假单胞菌(P.aerugi-nsa)、大肠埃希菌(E.li)、伤寒沙门菌(S.typhi)、平凡变形菌

3、(P.vulgaris)、异形柠檬酸杆菌(.diver-sus)、肺炎克雷伯菌(K.pneuniae)、暗沟肠杆菌(E.laa)、福氏痢疾杆菌(S.flexneri)、表葡菌(S.epideridis)、耐甲氧西林金葡菌(etheillinResistantStaphylusaureus，RSA)和白念珠菌(.albians)均为临床送检标本中分散菌株(重庆医科大学熏抱病学研究所提供)。(3)家蝇为田野捕捉人工多代生殖的种群。1.2重要试剂苯甲磺酰氟(PSF)由上海生工ARES分装，聚乙二醇为上海化学试剂总厂产物，氨苄西林药敏纸片为北京天坛生物所产物，SephadexG50(Siga公司)，卵

4、白质标识表记标帜(BIFerentas公司)，酵母抽提物、胰卵白胨(xid公司)，两性离子缓冲剂、丙烯酰胺、双丙烯酰胺和四甲基乙二胺(ARESD公司)。1.3重要试剂配制缓冲液A：0.1l/LpH6.8Tris-Hl缓冲液，含尿素2.0l/L，苯甲基磺酰氟化物0.1l/L，EDTA2l/L；缓冲液B：0.1l/LpH6.8磷酸盐缓冲液，PSF0.1l/L，EDTA0.02l/L；缓冲液：0.1l/LpH6.8磷酸盐缓冲液。1.4重要东西X-A108T碎冰机(广东番禺星威机器厂)，UF3TG超滤柱，.10000(illipre公司)，透析袋(Siga公司)，PharaiaLKB2152柱层析系列

5、(瑞士BRA公司)，Agilentll00series高效液相色谱仪(美国)，Lihrspher18色谱柱(汉邦公司)，PRTEINPAR300色谱柱(美国aters公司)。1.5免疫诱导3把盛有乙醚的造就皿放在蝇笼内，使蝇麻醉。然后用沾有细菌悬液(大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金葡菌)的不锈钢针刺透体壁，立即放入另一笼内使其清醒。刺伤后豢养24h。1.6构造液制备家蝇1.0g加液氮5g的比例混淆，敏捷用研钵研磨，加少量4缓冲液A，继承研磨成糊状，以1g构造加缓冲A10l的比例混匀，4下50000g离心60in，取上清液-80冰冻留宿，室温下融化，4下50000g离心60in，取上清液装入分子量截

6、留值为1200U的透析袋内，包埋于聚乙二醇中，在4下透析留宿。1.7抗菌肽纯化4待测样品溶液用UF3TG超滤柱以50000g离心超滤，在SephadexG50色谱柱加样12l，用活动相溶液以1.0l/in的流速举行洗脱，在214n检测波长下，举行样品的部门网络。网络的样品真空冷冻浓缩，反相高效液相半制备柱进一步分散纯化，阐发柱阐发。按照色谱柱型号差异决定上样量和流速，半制备柱为1.02.0l，流速为1.0l/in；阐发柱一样平常为10100l，流速为0.5l/in；检测波长为214n。将网络样品真空冷冻枯燥，浓缩后加双蒸水溶解，使体积为原体积的1/10，用Lry法举行卵白定量。1.8稀释法抗菌

7、试验2，31.9氨基酸测序5抗菌肽的PAGE胶块脱色后置于真空枯燥器中枯燥20in，然后参加510g/L的胰卵白酶液，4冰箱中安排40in后，加10l25l/L碳酸氢铵缓冲液，于37温育留宿。用5%TFA于40提取酶切肽段；再用同体积的AN-TFA溶液于30提取；末了用AN超声提取一次；归并3次提取液，真空枯燥器枯燥。枯燥后的样品用TFA溶液溶解。用装备有毛细管液相色谱和纳升喷雾源的纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(Nan-ESI-Q-TF2-S/S)技能测定肽段的质谱图，确定抗菌肽氨基酸序列。1.10检索数据库所测定得的质谱图用irass的专用软件asSeq直接推导出肽段序列，按照肽段的

8、氨基酸序列用SpetruList通过ast查询NBI数据库，建立其一级布局。2效果2.1家蝇抗菌肽抗菌谱断定效果用纸片琼脂扩散法即KB法(Kirby-Bauerethd)检测有抗菌活性的身分，再用微量稀释法(irdilutintest)测定最小抑菌浓度(inialinhibitrynentratin，I)。实行效果表现，分散到的家蝇抗菌肽分子量约9.0kU，具有显着的广谱抗菌活性，对革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌和真菌均有按捺作用。该抗菌肽对11种临床分散菌株的I在2.2213.33l/L(20120g/l)之间。家蝇抗菌肽对大肠埃希菌的抗菌活性相对较强，而对阳性球菌和其他肠杆菌的抗菌活性相对较弱

9、，对白念珠菌的抗菌活性最弱。在比较组，氨苄西林对10种临床分散菌株的I在21.5486.16l/L(832g/l)之间。临床分散菌株伤寒沙门菌、福氏痢疾杆菌敏感，大肠埃希菌、异形柠檬酸杆菌、暗沟肠杆菌中敏，铜绿假单胞菌、平凡变形菌、肺炎克雷伯菌、表葡菌和耐甲氧西林金葡菌(RSA)耐药。试验组和比较组对临床分散菌株的I见表1。2.2氨基酸测序抗菌肽被胰卵白酶水解后得到5个随机酶解片断，随机酶解片断用Nan-ESI-S/S技能举行质谱阐发，测定出的质谱信息借助irass的专用软表1家蝇抗菌肽对临床分散菌株的I用SpetruList通过ast查询NBInr数据库，经检索未创造有与之序列相匹配的卵白质

10、，可以证实本研究分散纯化到的家蝇抗菌肽是一个新的抗菌肽，定名为家蝇抗菌肽(usadestiaantibaterialpeptide，DAP)。3讨论由于抗生素的大量应用和滥用，临床耐药菌株和多重耐药菌株的产生不竭增长，抗熏染治疗形势非常严肃。特殊是比年来新型病原体的不竭出现和爆发盛行，探求广谱高效抗细菌、抗病毒药物仍旧刻不容缓。比年来生物抗菌肽的创造为抗熏染药物的开拓开拓了一个新途径。自然抗菌肽是生物体免疫体系产生的一类对抗外界病原体熏染的小分子肽，普及存在于昆虫、植物、动物及人体内。研究创造抗菌肽具有非特异性抗细菌、抗真菌的本领6，7，特殊是对多重耐药菌有按捺作用，有望成为治疗耐药性细菌的新

11、型药物或前体药物。蝇具有较强抗熏染本领810，家蝇抗菌肽的研究那么少有报道。本文对家蝇的研究，颠末一系列的卵白分散质纯化技能得到了纯化的具有较强抗菌活性的蝇家抗菌肽dAP。该抗菌活性肽与文献报道通过RT-图1家蝇抗菌肽胰卵白酶水解的肽段1的质谱图PR克隆并表达的抗大肠埃希菌活性的天蚕素分子布局完全差异11，用SpetruList通过ast查询NBI数据库，经检索未创造有与之序列相匹配的卵白质，可以证实本研究分散纯化得到的家蝇抗菌肽是一个新的抗菌肽。该抗菌肽的创造为探求高效广谱的抗菌物质提供了一个新途径。【参考文献】1PratesV,SfraL,Regis.TheNR-derivedslutin

12、struturefaneatiniantiirbialpeptidefrtheskinseretinftheanuranHylapuntataJ.JBilhe,2022,279(13):1301813026.2uugluKY,IngberA,GileadL,etal.aggttherapyfrthetreatentfintratableundsJ.IntJDeratl,1999,38(8):623627.3urthDD,LkeyTD,RenisHE,etal.Indutinferpin-likeandattain-likeantibaterialbutntantiviralativityinH

13、elithisviresenslarvaeJ.BiheBiphyResun,2022,200(1):3544.4孙毓庆主编.阐发化学(第四版).北京：人民卫生出书社，1999：272300.5王红霞，靳宝峰，王杰，等.纳升电喷雾串联质谱技能对阻断泛素通路诱导凋亡相干卵白的断定J.生物化学与生物物理学报，2002，34(5)：630634.6ilnerS,rtegaR.ReduedantiirbialpeptideexpressininhuanburnundsJ.Burns,1999,25(5):411413.7BalsR,angX,eegallaRL,etal.usebeta-defensin

14、3isaninduibleantiirbialpeptideexpressedintheepitheliafultiplergansJ.InfetIun,1999,67(7):35423547.8TaniaiK,TitaS.AnvellipplysahariderespnseeleentintheBbyxrierpinBprterJ.JBilhe,2000,275(18):1317913182.9rivelJ,RedekerV,LeaerJP,etal.Pneriins,neantibaterialandinsetiidalpeptidesfrthevenftheantPahyndylageldiiJ.JBilhe,2001,276(21):1782317829.10AlyR,GrantD,ahler-SlaskyY.Saharyeserevisiaeellsharbringthegene