TM4SF9在大肠侧向发育性肿瘤细胞株中的表达及意义

1、TM4SF9在大肠侧向发育性肿瘤细胞株中的表达及意义耿焱，姜泊，赖卓胜，张宏权，马文敏，王新颖【关键词】,大肠侧向发育型肿瘤ExpressinandsignifianefT4SF9inlaterallyspreadinglretaltur【Abstrat】AI:TinvestigatedifferentexpressinsfT4SF9inlaterallyspreadingtur(LST),LvandS480elllinesandtstudytherelatinshipbeteenT4SF9RNAexpressinandtheadhesinabilityftheseelllines.ETHDS

2、:ndifferentexpressingenesangthseelllineseredetetedbyirarraytehnlgyandT4SF9assreenedutfrfurtherresearh.Seiquantitativereversetransriptinplyerasehainreatin(RTPR)tehnlgyasusedtdenstratetheresultandtheadhesinabilityastestedbyadhesinexperient.RESULTS:irarrayshedthatthereasandifferentialexpressininT4SF9an

3、gLST,S480andLvelllinesandthisresultasdeterinedbyseiquantitativeRTPR.AdhesinexperientindiatedthattheelllineiththehighestT4SF9expressinshedthebestadhesinability.NLUSIN:ThereexistsandifferentexpressininT4SF9angLST,S480andLvelllines.T4SF9isverexpressedinLvhihhasthestrngestadhesinabilityandayregulatespei

4、fibilgialfuntinsfLST.【Keyrds】laterallyspreadingtur;T4SF9;prtEinarrayanalysis;reversetransriptaseplyerasehainreatin【摘要】目的：研究四分子交联体5T4SF9在大肠侧向发育性肿瘤laterallyspreadingturr,LST、S480和Lv细胞中的差异表达，以及T4SF9表达差异与三个细胞株黏附才能的关系.方法：用基因芯片技术研究3个细胞株的共同差异表达基因，从中挑选出T4SF9作为研究对象，用半定量RTPR技术验证基因芯片检查结果，用黏附实验研究3个细胞株黏附性的差异.结果：

5、基因芯片检查发现T4SF9在3个细胞株中都有表达，Lv细胞株表达最强，LST表达最弱，半定量RTPR检查与基因芯片检查结果相符，黏附实验显示T4SF9表达程度最高的细胞黏附性最强.结论：T4SF9在LST，S480，LV3个细胞株中存在差异表达，黏附性较强的细胞株表达较高，其与LST特性的关系值得进一步研究.【关键词】大肠侧向发育型肿瘤；四分子交联体5；蛋白质阵列分析；逆转录聚合酶链反响0引言平坦型大肠肿瘤包括表浅型和凹陷型，表浅型以大肠侧向发育性肿瘤laterallyspreadingturr,LST为代表1.LST特点是极少向肠壁深层垂直进犯，而主要沿黏膜外表呈侧向浅表扩散2.LST的癌变

6、率可达8.4%52.0%，并可以在3年内开展成为进展期大肠癌2，3.我国目前对LST病变的研究尚属空白.研究LST侧向生长及高恶变倾向的分子生物学机制，有可能对早期大肠癌的发生开展过程提供有价值的资料及线索，并在分子程度上找到早期诊断的可靠根据.我们通过基因芯片研究LST,Lv,S4803个细胞株的差异表达基因，挑选出四分子交联体5或称跨膜4超家族成员9transenberane4superfanily9,T4SF9作为研究对象，用半定量RTPR验证，用黏附实验研究3个细胞株黏附性的差异与T4SF9表达程度的关系，以讨论T4SF9与LST侧向生长及高恶变倾向的分子生物学机制的关系.1材料和方法

7、1.1材料大肠LST细胞株为南方医科大学消化病研究所建株并保存4.S480和Lv大肠癌细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所.人类全基因表达谱分析芯片H10001中科开瑞生物芯片公司；Trizl试剂Gib公司；RevertAidTHinusFirstStrandDNASynthesisKitFerentas公司；PreixPR试剂盒赛百盛公司；T4SF9基因片段引物参照基因文库N_005723序列设计，GAPDH参照文献4设计，博亚公司合成，序列:T4SF9:sense(197)5TTGTGGTGGGAGGAGTGAT3,antise(444)5TGGGTGAAGTTATGAGGTT3;GA

8、PDH:sense5ATGGAGAAGGTGGGG3,antise5AAAGTTGTATGGATGA3.3K30高速低温离心机Siga公司；UNIIPR扩增仪Bietra公司；UVI凝胶成像系统llagenISiga公司；48孔培养板rning公司.1.2方法1.2.1细胞培养3个细胞株均在3750L/L2条件下，培养于含10L/L小牛血清、100kU/L青霉素、100g/L链霉素的RPI1640中,每周传代2次.1.2.2基因芯片5,6用Trizl提取200g总RNA，按照ligtexRNAspinlunprtal别离纯化RNA.用通用测序PR引物扩增中科开瑞科技股份所提供的18816个基因

9、克隆作为模板.表达谱芯片由2个半张大小为812尼龙膜组成.每半张芯片上排列384个小矩阵1624，每个探针在矩阵中排布2点，平均点样量20ng.正方形方阵右上角设空白点作阴性对照，每4个方阵设1个阳性对照，在选定方阵的右下方方阵外.整张芯片共有8个看家基因，为常见的核蛋白体蛋白、核糖体蛋白等.BG600点样仪点样，紫外交联，晾干备用.在逆转录体系中参加RNA0.75g，LV酶2L，a33PdATP10L标记，按Prega公司提供说明操作.预杂交完毕后，弃去预杂交液，参加杂交液6L，变性过的鱼精DNA100g/L60L和40L标记好的探针.置入杂交炉中68杂交20h.杂交后严格洗膜，测量膜正面u

10、nts，磷屏压片72h.FLA3000扫描仪扫描芯片信号图像，ArrayGauge1.0软件分析.断定基因差异表达的标准：一对样本的信号平均值2或个2而另个10；信号值变异系数0.33；信号平均值有2倍以上表达差异的基因.1.2.3半定量RTPR取5g总RNA，按RevertAidTHinusFirstStrandDNASynthesisKit操作说明合成DNA.第一链.取DNA和两对引物20L/L各1L参加50L标准PR反响体系中成份见说明书，94预变性2.5in，然后进入以下32个循环：94变性45s，68退火1in，72延伸1in.循环完毕，72延伸5in.实验结果重复3次，取5L扩增产

11、物在20g/L琼脂糖凝胶中电泳，UVI凝胶成像系统成像，gelpranalyser3.2软件做半定量分析.PR扩增产物测序交博亚公司完成.1.2.4黏附实验LST,S480,Lv细胞株各组，每组设3个孔.取细胞对数生长期，用无血清RPI1640培养过夜.10g/Lllagen溶液1PBS配制每孔150L，置37铺板1h.10g/LBSA1PBS配制煮沸13in变性后，每孔加200L封闭1h，封闭完毕后用1PBS冲洗2次.用2.5g/L胰蛋白酶消化细胞，1PBS洗涤细胞，800r/in,5in离心沉淀细胞，弃上清，将细胞重悬于含氯化钙1l/L，氯化镁1l/L，氯化锰0.21l/L及5g/LBSA

12、的RPI1640中，调整细胞密度为1108/L.按200L/孔参加细胞悬液，37温育1h.取出48孔板，1PBS冲洗5次，33g/L甲醛固定，相差显微镜下每空随机取6个高倍镜视野计数.统计学处理：数据以xs表示，应用SPSS软件对数据进展转换，在方差齐性的根底上应用方差分析，组间两两比拟用LSD法，P0.05表示有统计学意义.2结果2.1基因芯片性能尼龙膜上LST,S480,Lv重复点的R2分别为0.9716(y=0.9773x),0.9858(y=0.9794x)和0.9823(y=0.9959x)，提示芯片重复性好.LST,S480,Lv细胞株之间符合挑选标准的差异表达基因97个，其中共上

13、调58个，共下调39个.差异表达的基因按功能分类显示以信号传导传递、代谢、发育和分化类为最多.选择T4SF9作为研究对象.T4SF9属于信号传导传递、发育和分化类基因，在LST，S480和Lv中的信号值分别为0.6712,4.9445和15.7723,Lv较LST上调表达20倍，较S480上调表达10倍.2.2基因分析琼脂糖凝胶电泳显示T4SF9和GAPDH扩增片断大小分别在247bp和195bpFig1，测序结果证实为T4SF9基因片断.实验重复3次，LST,S480,Lv相对表达量T4SF9/GAPDH分别为0.340.08,0.580.07,0.780.11,F值为19.235(P0.0

14、1)，其中LST低于S480,LvP0.05，S480低于LvP0.05.2.3LST黏附细胞LST黏附细胞数明显少于LvP0.001和S480P0.001,Lv的黏附细胞数多于S480P0.01.T4SF9表达最强的Lv细胞株黏附性最强(Tab1).表1LST,S480,LV黏附细胞数略3讨论四分子交联体tetraspanin超家族，又称跨膜4超家族transenberane4superfanily,T4SF，是一组以四次跨膜及两个大小不等的细胞外环状构造为主要特征的膜外表蛋白7.T4SF成员可通过彼此间以及其他类型膜外表蛋白的联络，形成四分子交联体网tetraspanineb，调节细胞的运

15、动性，激发同类型的细胞的聚集，多种类型细胞的交融，以及细胞的信号传导，对恶性肿瘤细胞的转移才能有重要影响8.目前对T4SF9的研究主要集中在神经系统，它可以影响小鼠的神经细胞及神经胶质细胞的黏附、运动和增殖9,10，鲜有其与大肠癌关系的报道.我们在研究发现，在LST,S480,Lv细胞株中存在着T4SF9差异表达，黏附才能最强的Lv细胞株表达最强，提示T4SF9可能与大肠癌细胞的粘附才能有关.基因芯片显示差异表达的基因以信号传导传递、代谢、发育和分化类为最多，而T4SF9属于信号传导传递、发育和分化类基因，提示T4SF9可能与LST的特殊生物学行为有关.我们将对其做进一步的研究，一方面为解释L

16、ST侧向生长及高恶变倾向的分子生物学机制奠定根底，一方面加深对T4SF9功能的理解，以期发现新的肿瘤相关基因.【参考文献】1姜泊，刘思德.重视平坦型大肠肿瘤的临床诊治J.解放军医学杂志,2022;29(11):925-927.JiangB,LiuSD.PayephasistthediansisandtreatentfflattursflnJ.edJhinPLA,2022;29(11):925-927.2NakageT,IshikaaH,SaaiT,etal.Gasless,videendspitransanalexisinfrarinidandlaterallyspreadingtursfth

17、eretuJ.SurgEnds,2022;17(4):1298-1304.3TauraS,NakajK,YkyaaY,etal.EvaluatinfendspiusalresetinfrlaterallyspreadingretaltursJ.Endspy,2022;36(1):306-312.4赖卓胜，韩宇晶，刘思德，等.大肠侧向发育型肿瘤细胞株的建立及其鉴定J.解放军医学杂志,2022;29(11):934-937.LaiZS,HanYJ,LiuSD,etal.EstablishentfanvelepithelialelllinefrlaterallyspreadingturflnJ.ed

18、JhinPLA,2022;29(11):934-937.5范德刚，范清宇，张惠中，等.利用基因芯片技术挑选不同转移才能骨肉瘤细胞差异表达基因J.第四军医大学学报,2022;24(9):816-819.FanDG,FanQY,ZhangHZ,etal.StudynetastasisassiatedgeneinstesarabyDNAirarrayJ.JFurthiledUniv,2022;24(9):816-819.6杨磊，顾永清，潘泽民，等.长期砷诱导L02细胞的表达谱基因芯片实验J.第四军医大学学报,2022;25(13):1205-1207.YangL,GuYQ,ZhangHZ,etal.ExpressinfingerprintanalysisfhrniarseniteinduedL02ellusingDNAirarryJ.JFurthiledUniv,2022;25(13):1205-1207.7artinE.Heler.SpeifitetraspaninfuntinsJ.ellBil,2001;155(7):1103-1108.8laudeB,GuyH,ThienD,etal.TetraspaninsandalignanyJ