亲和层析讲稿

1、关于亲和层析第一张，PPT共五十五页，创作于2022年6月第一节亲和层析概述利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术 配体固定化的问题 在生物分离中有广泛的应用 第二张，PPT共五十五页，创作于2022年6月历史1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的实例。 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。 1967年Axen等用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法，并成功地制备了固定化酶。此技术的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层析技术得到了快速的发展。 生物大分子的分离第三张，PPT共五十五页

2、，创作于2022年6月第二节亲和层析基本原理及理论基础亲和力配体 固定相 原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。 第四张，PPT共五十五页，创作于2022年6月亲和力 生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们熟悉的抗原抗体、酶底物或抑制剂、激素受体等等，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和作用的本质：钥匙和锁孔的关系静电作用氢键疏水性相互作用配位键弱共价键 第五张，PPT共五十五页，创作于2022年6月配体 与 固定相亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基

3、质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，eg:底物类似物或竞争性抑制剂,抗原 配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂. Eg:Sepharose ,第六张，PPT共五十五页，创作于2022年6月一、亲和层析基本原理第七张，PPT共五十五页，创作于2022年6月分离原理将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得

4、到了纯化的待分离物质 第八张，PPT共五十五页，创作于2022年6月二、亲和层析的特点分辨率很高 分离速度快 操作简便 对设备要求不高 亲和吸附剂通用性较差 洗脱条件较苛刻 第九张，PPT共五十五页，创作于2022年6月与其他层析技术比较吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等都是利用各种分子间的理化特性的差异，如分子的吸附性质、分子大小、分子的带电性质等等进行分离。由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以这些方法的分辨率往往不高。要分离纯化一种物质通常需要多种方法结合使用，这不仅使分离需要较多的操作步骤、较长的时间，而且使待分离物的回收率降低，也会影响待分离物质的活性。亲和层析是利用生物分子

5、所具有的特异的生物学性质亲和力来进行分离纯化的。由于亲和力具有高度的专一性，使得亲和层析的分辨率很高，是分离生物大分子的一种理想的层析方法。 第十张，PPT共五十五页，创作于2022年6月三、亲和层析的类型生物亲和层析 免疫亲和层析 固定化金属离子亲和层析 拟生物亲和层析 第十一张，PPT共五十五页，创作于2022年6月生物亲和层析 利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和层析。通常具有高的选择性。典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素-受体等。 第十二张，PPT共五十五页，创作于2022年6月免疫亲和层析 利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统，称免疫亲和层析。免疫亲

6、和层析应用相当广泛，许多典型的亲和层析纯化蛋白质的过程已经使用了单克隆抗体作为亲和配体。目前，利用抗体抗原模式，有可能得到每一种目标蛋白的单抗，然后以单抗为配基，通过亲和层析技术分离纯化目标蛋白质。此种方法的纯化倍数活性回收率非常高。用免疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免疫检测法，特别适用于检测含量低微的样品4，免疫检测法利用被标记的抗体或模拟分析物来进行间接的被分析物的分析。常用标记如酶标记、荧光标记、化学荧光等。第十三张，PPT共五十五页，创作于2022年6月固定化金属离子亲和层析 是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组

7、氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合，这是IMAC用于蛋白质分离纯化的根据5,6。金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巯基结合。含有不同数量的这些基团的蛋白质可以通过金属离子亲和层析得到分离。 第十四张，PPT共五十五页，创作于2022年6月拟生物亲和层析 是利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位。以人工合成的配基为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析，如以染料亲和层析（DAFC）和氨基酸(包括多肽)亲和层析(AALA)7。染料配基，例如三嗪（triazine）或三苯甲烷化合物8，能通过共价键牢固地结合到亲和载体上。染

8、料配体与很多蛋白以及酶的活性位点相互作用，以模仿这些生物分子的底物、辅助因子或结合剂的形式进行。 第十五张，PPT共五十五页，创作于2022年6月四、亲和层析载体（一）亲和层析对载体的要求载体要具有足够数量的功能基团有较好的理化稳定性和生物惰性 有高度的水不溶性和亲水性 有多孔的立体网状结构 载体在亲和层析中的作用：使配基固定化、空间环境第十六张，PPT共五十五页，创作于2022年6月（二）常用载体 纤维素 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 葡聚糖凝胶 多孔玻璃珠 第十七张，PPT共五十五页，创作于2022年6月1. 纤维素 它是自然界中数量最大的大分子生物材料，取材十分方便。但由于纤维素结构紧密、

9、均一性差，不利于大分子的渗入。活化后因带有电荷，非特异性吸附力较强，加上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。目前主要用于分离与核酸有关的物质，如用寡聚脱氧胸腺核苷酸纤维素作固定相分离细胞提取液中的mRNA。市售纤维素商品为无定形微纤维、微晶纤维素以及珠状纤维素。 第十八张，PPT共五十五页，创作于2022年6月2. 琼脂糖凝胶 是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相互结合的链状多糖，用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。琼脂糖浓度有2%、4%、6%几种，相应的商品称为Sepharose2B、4B和6B(Pharmacia)和Ultrogels A-2，A-4，A-6(LKB)。这类载体能使

10、吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。例如，Sepharose 4B的分子量排阻极限达上百万，便于大分子通过；载体几乎没有带电基团，非专一性吸附少。Sepharose CL是用1,3-二溴丙烷处理的交联琼脂糖，它的稳定性明显增加，能在pH 314中应用，Sepharose CL凝胶的这种稳定性，扩大了亲和柱制备时化学反应选用的范围，并能经受比较剧烈的洗脱条件。第十九张，PPT共五十五页，创作于2022年6月3. 聚丙烯酰胺凝胶 是由丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺经催化聚合形成的人工合成载体，是具有网状三维空间结构的凝胶型高聚物，商品名为Biogel P。与葡聚糖凝胶

11、一样，它也是一种干胶，遇水后溶胀成多孔凝胶。它具有稳定的理化性能，适用于稀盐溶液、洗涤剂、盐酸胍等溶液和许多有机溶剂，不受酶或微生物代谢产物的影响；有较多的可供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。但是pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解，还应避免接触强氧化剂。此外，配基偶联后会使它的网格缩小，在一定程度上限制了它的应用。 第二十张，PPT共五十五页，创作于2022年6月4. 葡聚糖凝胶 是经环氧氯丙烷交联，具有立体网格的多糖类物质，其物理及化学性能比较稳定。与琼脂糖凝胶相比较，葡聚糖凝胶孔径太小，特别是经配基偶联后，凝胶膨胀度会进一步变小，所以它的应用也受到一

12、定限制。 亲和柱的不可逆吸附杂质(如变性蛋白、脂类等)可用强碱处理除去。（产品说明）第二十一张，PPT共五十五页，创作于2022年6月sephadex第二十二张，PPT共五十五页，创作于2022年6月第二十三张，PPT共五十五页，创作于2022年6月5. 多孔玻璃珠(商品为Bio-Glass) 它的化学与物理稳定性较好，机械强度高，不但能抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和较剧烈的反应条件。缺点是亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，而且可供连接的化学活性基团也少。为了克服上述缺点，作载体用的市售Bio-Glass的商品都已事先连接了氨烷基(烷基胺)。用葡聚糖包被玻璃珠则可改

13、善其亲水性，并增加化学活性基团。用抗原涂布的玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细胞，在DNA连接的玻璃珠上纯化了大肠杆菌的DNA和RNA聚合酶。 第二十四张，PPT共五十五页，创作于2022年6月载体pH范围交联琼脂糖纤维素葡聚糖硅胶玻璃聚丙烯酰胺羟乙基异丁烯酸环氧乙烷-丙烯酸聚合物苯乙烯-二乙烯苯聚合物聚丙烯醇N-丙烯酰基-2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇聚四氟乙烯21411421488310212012113114111不受pH影响第二十五张，PPT共五十五页，创作于2022年6月五、亲和配基 （一）配基的选择 配基与待分离的物质有适当的亲和力 配基与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性

14、 配基要能够与基质稳定的共价结合 配基自身应具有较好的稳定性 第二十六张，PPT共五十五页，创作于2022年6月（二）配基的浓度 （三）配基偶联的位置（四）配基分子的大小（五）配基的类型 第二十七张，PPT共五十五页，创作于2022年6月配基的浓度 在亲和势比较低的时候，增加配基浓度有利于吸附。配基浓度太高容易使大分子配基上的活性中心互相遮盖，反而使亲和柱吸附力降低。 配基浓度太高又会使吸附力太强，造成洗脱上的困难；另外，随着配基浓度的增加，非专一性吸附也增加，而专一性吸附却降低。作为一个有效的吸附剂，理想的配基浓度为110 mol/L，并以2 mol/L的凝胶为最好。 第二十八张，PPT共五

15、十五页，创作于2022年6月配基偶联的位置 在一般情况下，亲和结合时配体分子与配基分子仅有一部分发生相互作用。 为了保证亲和吸附剂有足够大的亲和能力，我们希望配基固定化时，其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联。 第二十九张，PPT共五十五页，创作于2022年6月配基分子的大小 制备亲和柱时，应首先选用大分子配基，因为小分子配基可供识别、互补的特殊结构较少，一旦偶联到载体上后，这种识别的结构更少。 小分子配基时，由于酶的活性中心常是埋藏在结构的内部，它们与介质的空间障碍影响其与亲和配基的结合作用。 为了改变这种情况可在载体和配基间插入一个“手臂” 以消除空间障碍，手臂的长度是有限的，太短不能起消

16、除空间障碍的作用。太长往往使非特异性的作用如疏水作用增强。 脂肪族二胺类化合物与琼脂糖偶联。第三十张，PPT共五十五页，创作于2022年6月配基的类型 根据配基对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配基（specific ligand）和通用性配基（general ligand）。 特异性配基一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。Eg:抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素受体 通用性配基一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配基， eg:凝集素、核酸 第三十一张，PPT共五十五页，创作于2022年6月第三节亲和层析的操作过程一、基质的活化对基

17、质进行一定的化学处理 （一）多糖基质的活化：溴化氰活化 、环氧乙烷基活化 （二） 聚丙烯酰胺的活化：甲酰胺基的修饰 （三） 多孔玻璃珠的活化 ：硅烷化试剂与玻璃反应生成烷基胺玻璃 第三十二张，PPT共五十五页，创作于2022年6月溴化氰活化 环氧乙烷基活化 第三十三张，PPT共五十五页，创作于2022年6月聚丙烯酰胺的活化 第三十四张，PPT共五十五页，创作于2022年6月二、间隔臂分子（手臂）空间位阻效应 加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的骨架向外扩展伸长。 第三十五张，PPT共五十五页，创作于2022年6月第三十六张，PPT共五十五页，创作于2022年6月三、配基偶联的方法 （一）

18、碳二亚胺缩合法 （二）酸酐法（三）叠氮化法 （四）重氮化法 第三十七张，PPT共五十五页，创作于2022年6月碳二亚胺缩合法 第三十八张，PPT共五十五页，创作于2022年6月酸酐法 用-氨基烷基琼脂糖(或丙烯酰肼衍生物)与1%的琥珀酸酐水溶液作用，生成琥珀酰氨烷基琼脂糖衍生物(含羧基的载体)。 第三十九张，PPT共五十五页，创作于2022年6月叠氮化法 第四十张，PPT共五十五页，创作于2022年6月重氮化法 氨基烷基琼脂糖衍生物，在pH9.3的硼酸钠(或三乙胺)和40%(V/V)N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，与对硝基苯叠氮化合物在室温反应1 h，制得对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。

19、 产品先依次用50%DMF、25%DMF和水充分洗涤，接着用0.1 mol/L连二亚硫酸钠在4050还原40 min，最后在0、0.5 mol/L HCl溶液中用0.1 mol/L亚硝酸钠处理7 min，制得重氮盐衍生物。将所需配基与该琼脂糖重氮衍生物偶联反应，便可制得亲和层析柱。 第四十一张，PPT共五十五页，创作于2022年6月四、用于固定化配基的凝胶衍生物Sepharose CNBr活化的Sepharose 4BAH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B 环氧活化型Sepharose 6B第四十二张，PPT共五十五页，创作于2022年6月五、影响吸附剂亲和力的几个因素

20、微环境的影响 空间障碍的影响 配基浓度对亲和力的影响 配基与载体的结合位点的影响 载体孔径的影响 第四十三张，PPT共五十五页，创作于2022年6月（一）微环境的影响 载体和“手臂”的存在会引起离子交换作用的发生，影响亲和吸附剂的吸附特异性。极性很低或无极性的基团则由于疏水作用的存在，也会引起非特异性吸附作用。有时则有助于亲和力的提高，加强了亲和层析的效果； 配基与载体和“手臂”氢键的相互作用可能会使其强烈缔合，从而妨碍了与配体的亲和结合。 第四十四张，PPT共五十五页，创作于2022年6月（二）空间障碍的影响 有的亲和对两物质间原有很高的亲和力，但当其一方制成亲和吸附剂时，与相应配体的亲和力

21、可能完全丧失。 这种现象对于亲和力低的或分子量特大的亲和对以及小分子配基更明显。 需要在载体与配基之间插入一段适当长度的“手臂” 第四十五张，PPT共五十五页，创作于2022年6月（三）配基浓度对亲和力的影响 对于低亲和力系统，为了取得较好的配体分离效果，必须提高载体上配基的有效浓度。 较高的配体浓度在亲和层析时呈现“累增效应”，即提高了亲和吸附剂的吸附能力。 第四十六张，PPT共五十五页，创作于2022年6月（四）配基与载体的结合位点的影响 在多肽或蛋白质等大分子作配基时，由于它们具有数个可供偶联的功能基团，必须控制偶联反应的条件，使它以最少的键与载体连接，这样有利于保持蛋白质原有的高级结构，从而使亲和吸附剂具有较大的亲和能力。第四十七张，PPT共五十五页，创作于2022年6月（五）载体孔径的影响载体的孔隙是配体向配基接近的运动通道。所以载体的孔径大小对吸附剂的亲和能力有决定性影响。 当配基和大分子对象的亲和力十分高(如抗原与抗体)，或是配体是很大的颗粒(如细胞器和完整细胞)，载体的多孔性就显得不很重要了，那是因为配体与配基的作用仅发生在凝胶表面。第四十八张，PPT共五十五页，创作于2022年6月六、亲和层析的基本操作 亲和吸附剂选择制备 上样 洗脱 亲和吸附剂的再生和保存 第四十九张，PPT共五十五页，创作于2022年6月第五十张，PPT共五十五页，创