生物化学实验-Folin-Wu法定量测定

1、Folin-Wu法定量测定血糖的含量中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室1.氧化供能 2.人体的主要组成成分之一 糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；转化成脂肪和某些非必需氨基酸等3.糖代谢紊乱供能障碍一系列代谢变化 糖的重要生理功能：中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室血糖及血糖水平的概念：血糖：指血液中的单糖：葡萄糖血糖水平：血浆中葡萄糖浓度血糖总维持在恒定水平：3.96.7mmol/L中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室 血糖的来源和去路中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室血糖测定的目的和意义临床：血糖检测是目前诊断糖代谢

2、异常相关疾病的主要依据。科研：在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些药物的研究中，也涉及血糖的测定。调节血糖水平的激素：胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。血糖水平异常：高血糖及糖尿病；低血糖中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室 高血糖症：指空腹血糖浓度超过7.3mmol/L,有生理性和病理性之分，临床上最常见的病理性高血糖症是糖尿病。糖尿病：是一种慢性、复杂的代谢紊乱性疾病,系胰岛素绝对不足或相对不足，以高血糖症为基本生化特点。同时伴有糖、脂类、蛋白质、水、电解质和酸碱平衡紊乱，甚至出现一系列并发症如眼、肾的微血管病变及神经病变等。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化

3、与分子生物学实验室 症状随机血浆葡萄糖 11.1mmol/L,或空腹血浆葡萄糖 7.0mmol/L。症状不典型者需另一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时间采血测得的血糖浓度。糖尿病典型的症状是“三多一少”，即多饮、多尿、多食及消瘦糖尿病的诊断标准中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室血糖的测定方法测定方法酶法：（1）己糖激酶法（HK）（2）葡萄糖氧化酶法（GOD法）特异性高，灵敏度高，干扰因素少，适用于自动化分析，为葡萄糖测定的参考方法，但是试剂较贵无机化学法： Folin-Wu法，特异性差有机化学法：邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法干扰因素多中国海洋大学生物基础实验教学中

4、心生化与分子生物学实验室掌握FolinWu法测定血糖含量的原理和方法。学会制备无蛋白血滤液。掌握7200型可见分光光度计的使用方法。一、目的要求中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室二、实验原理葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基，Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）而沉淀。 Cu2+( CuSO4 )+葡萄糖 Cu+ （Cu2O）无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应, Cu2O又把酸性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝色钼化合物钼蓝 。Cu2O+酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物 OD420比色 血滤液

5、中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比，而Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室三、实验仪器1、25mL血糖管3支；2、血糖管橡胶塞3个；3、沸水浴小锅1个； 4、100mL锥形瓶2个；5、电炉1个；6、滤纸1盒；7、吸耳球2个； 8、7200型分光光度计1台;血糖管7200型分光光度计中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室 1、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）(1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。(2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶

6、中，加蒸馏水定容。2、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。4、碱性硫酸铜溶液 A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml. B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。 临用时，A液：B液=9：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4）。 四、实验试剂中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室5、酸性钼酸盐溶液：称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，

7、加溴水0.5ml，摇匀，静止数小时后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加25%硫酸150ml。置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml，摇匀，用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。 四、实验试剂中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室1、无蛋白血滤液的制备：用5ml移液管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。再加0.33mol/L H2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置515分钟，至沉淀变为暗棕色

8、（如不变色可再加0.33mol/L H2SO41-2滴）。用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。五、实验步骤中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室2、血糖的定量测定：取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入2ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇动，各加4ml酸性钼酸盐溶液。一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用72

9、00分光光度计在420nm波长处比色，以空白管调节零点。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室按下式计算100ml全血中所含血糖的含量m=A1/A0C00.1100式中: m=100ml全血中含血糖毫克数 ; C0=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml）；A1=样品液光吸收值 ; A0=标准液光吸收值 0.1：1ml无蛋白血溶液相对于0.1ml全血六、结果计算：中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室七、思考题实验过程中那些操作可能影响实验结果的准确性？实验中，血糖管有什么作用？实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？中国海洋大学生物基础实验教

10、学中心生化与分子生物学实验室注意事项：1.加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加入10硫酸1-2滴，待暗棕色后再过滤。3.用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。 中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室五、实验步骤1、无蛋白血滤液的制备：蒸馏水7ml 摇匀 10%钨酸钠1ml 摇匀 0.33mol/L H2SO41ml 边加边摇,加毕充分摇匀 放置515分(沉淀变为暗

11、棕色)(如不变色,再加0.33mol/L H2SO412滴 )干滤纸过滤 无蛋白血滤液(每毫升相当于1/10ml全血)20ml锥形瓶溶血(变为红色透明)用5ml移液管取全血1ml（已加抗凝剂2、血糖的定量测定：m=OD1/OD2 C 10 100中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室分光光度计的工作原理中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室朗伯-比尔定律朗伯定律：A=k1L 比尔定律：A=k2C朗伯-比尔定律：如同时考虑液层厚度和溶液浓度对吸光度的影响，则吸光度与溶质的浓度和溶液的厚度的乘积成正比。 A=KLC 中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实

12、验室朗伯-比尔定律应用A标=KC标LA样=KC样L 标准品法测定未知样品含量C样=A样A标C标中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室7200型分光光度计的操作程序连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。接通电源，使仪器预热20分钟。用键设置测试方式：投射比（T），吸光度（A），已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F）方式。用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第二个槽位中

13、。将0T校具（黑体）置入光路中，在T方式下按“0T”键，此时显示器显示“000.0”中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室按 MODE键选择A模式将参比样品拉入光路中，按“0A/100T”键调0A/100T，此时显示器显示的“BLA”直至显示“0.000”A为止。当仪器显示器显示出“0.000”A后，将被测样品推入光路，这时，您便可从显示器上得到被测样品的吸光度。中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室 分光光度计的使用注意事项:比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此，特别要将比色皿清洗干净。装样前处理：自来水反复冲洗蒸馏水漂洗2次待装溶液漂洗2次。用完后用自来水和蒸馏水洗净并用檫镜纸檫干放回比色皿盒中。 中国海洋大学生物基础