生物化学A（上）8-蛋白质化学6-理化性质与分离分析

1、蛋白质的理化性质、测定及分离纯化蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质及应用蛋白质分子量大，是一种胶体溶液；具有特定的空间构象，分子量一定分子筛层析；在大部分pH条件下，蛋白质分子同时存在两种电荷等电点沉淀，盐溶，盐析，电泳，离子交换层析等；一般而言，蛋白质分子上同时存在疏水和亲水区域有机溶剂沉淀，疏水层析(反相层析)。蛋白质的胶体性质 蛋白质分子量大，介于一万到百万之间，故其分子的大小已达到胶粒1-100 nm范围之内。球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈吸引水分子的作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围-水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集。 与低分子物质相比，蛋白质分子扩散速度慢，不易透过

2、半透膜，粘度大，在分离提纯蛋白质过程中，可以利用蛋白质的这一性质，将混有小分子杂质的蛋白质溶液置于半透膜制成的透析袋或管内，浮于流动水或适宜的缓冲液中，小分子杂质皆易从袋中透出，保留了比较纯的蛋白质-透析(dialysis)。颗粒大小：在1-100 nm之间，属胶体，因此溶于水，成为亲水胶体。 稳定亲水胶体的因素： 水化膜 表面电荷相同 不通透性：半透膜(semipermeable membrane)蛋白质溶液是一种分散系统，蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质。分散相质点小于1 nm为真溶液，大于100 nm为悬浊液，介于1-100 nm为胶体溶液。透析即用半透膜（透析袋）将大分子蛋白质分离

3、出来。在生物大分子制备过程中除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品，透析法最简便。透析时，小于MWCO（截留分子量）的分子在透析膜二边溶液浓度差产生的扩散压作用下渗过透析膜，其速度与浓度梯度、膜面积及温度成正比。欲快速透析可采用直径较小的透析袋以增加膜面积。常用温度：4，升温、更换袋外透析液或用磁力搅拌器，均能提高透析速度。 MWCO: molecular weight cut-off疏水区域蛋白质分子上的电荷与疏水区蛋白质大分子溶液在一定溶剂中超速离心时可发生沉降。沉降速度与向心加速度之比值即为蛋白质的沉降系数S。 s=v/2r s是沉降系数(sedimentation coeffi

4、cient)，是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降时间表示，蛋白质、核酸、核糖体、病毒等的沉降系数通常为1-200 10-13秒范围，10-13这个因子叫做沉降单位S（斯维德贝格单位，Svedberg unit），即1S=10-13秒，如血红蛋白的S约为410-13秒或4S。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。 蛋白质的两性电离和等电点 蛋白质由氨基酸组成，分子中除两端的游离氨基和羧基外，侧链中尚有一些解离基，如Glu、Asp残基中的和-羧基，Lys残基中的-氨基，

5、Arg残基的胍基和His的咪唑基。作为带电颗粒，可以在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带的电荷性质。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液pH影响。当处于某一pH时，蛋白质兼性离子(zwitterion)的净电荷为0，此时溶液的pH值为蛋白质的等电点(isoelectric point，pI)。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。蛋白质溶液的pH大于等电点，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。 溶液中的蛋白质颗粒 pH=pI时，蛋白质分子所带净电荷为零，蛋白质分子在电场中不移动。 pHpI时，蛋白质分子所带净电荷为负，蛋白质分子在电

6、场中向阳极移动。 pHpI时，蛋白质分子所带净电荷为正，蛋白质分子在电场中向阴极移动。 在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用，所以不稳定，溶解度最小，易沉淀。蛋白质在等电点时的溶解度最小pH与盐浓度对蛋白质溶解度的共同作用蛋白质的变性(Denaturation) 天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下，其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性，即蛋白质的变性作用(denaturation)。变性只是蛋白质空间构象的破坏，一般认为蛋白质变性的本质是次级键、二硫键的破坏，并不涉及一级结构的变化。 引起蛋白质

7、变性的因素引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两大类。物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在临床医学上，变性因素常被应用于消毒及灭菌。反之，注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂。在变性因素的作用下，可导致各种变性现象。首先是生理活性丧失，如酶变性后，失去催化功能；激素变性后，失去生理调节功能；微生物体内的蛋白质变性后，微生物失去生命力而死亡。这是变性作用最主要的特征。此外，变性后的蛋白质还表现出各种物理和化学性质的改变。天然蛋白质变性后，多肽链松弛伸展，导致粘度增大，内部的侧链疏水基

8、团暴露于表面，导致溶解度下降而易沉淀。同时由于变性后，结构松散，侧链基团暴露，还使得其易于发生化学反应，例变性蛋白质容易被酶水解。由于疏水侧链暴露，可能导致紫外吸收增加。变性与复性 变性并非是不可逆的变化，当变性程度较轻时，去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性(renaturation)。如核糖核酸酶中四对二硫键及其氢键，在-巯基乙醇和8 M尿素作用下，发生变性，失去生物学活性，变性后如经过透析去除尿素，-巯基乙醇，并对空气缓慢氧化使疏基氧化成二硫键，酶蛋白又可恢复其原来的构象，酶学活性也几乎全部恢复，称为变性核糖核酸酶的复性。 许多蛋白质变性时

9、被破坏严重，即使撤去变性因素也不能恢复，称为不可逆性变性。RNase的变性与复性盐 析 (Salting Out) 在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质胶体的稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来，盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。 蛋白质的盐溶和盐析硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度（硫酸铵浓度）盐

10、析盐溶蛋白质的沉淀 (Precipitation) 蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象-蛋白质沉淀，变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。 蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。若无外加条件，不致互相凝集。然而除掉这两个稳定因素(如调节溶液pH至pI和加入脱水剂)，蛋白质便容易凝集析出。但如将溶液pH调节到蛋白质pI，蛋白质分子呈等电状态，虽然分子间同性电荷相互排斥作用消失了。但是还有水化膜起保护作用，一般不致于发生凝聚作用，如果这时再加入某种脱水剂，除去蛋白质分子的水化膜，则蛋白质分子就会互相凝聚而析出沉淀

11、；反之，若先使蛋白质脱水，然后再调节pH到等电点，也同样可使蛋白质沉淀析出。+-+-蛋白质胶体颗粒的沉淀（沉淀）（疏水胶体）（疏水胶体）重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀，沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。因为此时蛋白质分子有较多的负离子，易与重金属离子结合成盐。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。 临床上利用蛋白质能与重金属盐结合的这种性质，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 蛋白质可与生物碱试剂(如

12、苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。 临床血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。有机溶剂沉淀蛋白质 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。不可逆沉淀指沉淀出来的蛋白质分子，其内部结构发生了较大的改变，蛋白质已失去了原来的生物活性

13、，即使沉淀因素消失，沉淀也不重新溶解。在蛋白质溶液中加入某些水溶性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等，由于这些溶剂与水的亲和力大于蛋白质，破坏了蛋白质胶体外层的水化膜，并可逐步进入蛋白质的内部，有利于蛋白质的沉淀，此种作用在短时间及低温时，沉淀是可逆的，但作用时间长或温度较高时，则是不可逆沉淀。三氯乙酸、苦味酸、磷钨酸、鞣酸等生物碱沉淀试剂，能与蛋白质阳离子结合生成不溶物, 而使蛋白质发生不可逆沉淀。如： +H3N-Pr-COO- + Cl3C-COO- H2N-Pr-COO-O-CO-CCl3 Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等重金属阳离子，能与蛋白质阴离子结合生成不溶物，使蛋白质发生不可逆沉淀

14、。例如： H2N-Pr-COO- +Ag+ H2N-Pr-COOAg加热凝固 (Coagulation) 将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固而沉淀。加热首先使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。 蛋白质的变性、沉淀、凝固之间有密切的关系。但蛋白质变性后并不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近才沉淀，沉淀的变性蛋白质也不一定凝固。如蛋白质被强酸、强碱变性后由于蛋白质颗粒带有大量电荷，仍溶于强酸或强减之中。但若将强碱或强酸溶液的pH调节到pI，则变性蛋白质凝集成絮状沉淀

15、物，若将此絮状物加热，则分子间相互盘缠而变成较为坚固的凝块。蛋白质的紫外吸收波长：280 nm引起紫外吸收的因素：主要是色氨酸( Trp）和酪氨酸（ Tyr)的共轭双键，Phe在紫外光下也有光吸收。可用于蛋白质的定量测定。波长范围：200-400nm蛋白质的颜色反应 I 1. 双缩脲反应(biuret reaction)，蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称双缩脲反应。凡分子中含有两个以上CONH键的化合物都呈此反应，蛋白质分子中氨基酸是以肽键相连，因此所有蛋白质都能与双缩脲试剂发生反应。2. 米伦反应(millon reaction)，蛋白质溶液中加入米伦试剂(亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸

16、的混和液)，蛋白质首先沉淀，加热则变为红色沉淀，此为酪氨酸的酚核所特有的反应，因此含有酪氨酸的蛋白质均呈米伦反应。3. 茚三酮反应(ninhydrin reaction) ，氨基酸与水合茚三酮(苯丙环三酮戊烃)作用时，产生蓝色反应，由于蛋白质是由许多氨基酸组成的，所以也呈此颜色反应。4. 黄蛋白反应，蛋白质分子中若存在含有苯环的氨基酸（如Tyr、Phe等），当其与硝酸共热时，则呈黄色，再加碱则颜色变为橙黄。这一反应称为黄蛋白反应。一般蛋白质常含有Tyr和Phe残基，因此这一反应是蛋白质较为普遍的颜色反应。蛋白质的颜色反应 II 5. 含硫蛋白质的反应，如果蛋白质分子中含有Cys或Met等含硫氨

17、基酸残基，当与碱及醋酸铅共热时，分解产生的硫遇铅盐即产生黑色的硫化铅沉淀。6. 色氨酸反应，将蛋白质溶液与几滴乙醛酸混合后，再沿器壁慢慢加入浓硫酸，如果蛋白质分子侧链中有吲哚环，则两液层的界面上会出现紫色环，这个反应称为色氨酸反应，又称为乙醛酸反应或霍普金（Hopking）反应。可用来检验蛋白质或肽的分子中是否有Trp残基。蛋白质的颜色反应 III蛋白质定性定量分析蛋白质的定量测定一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，以下几种食品的蛋白质含量大约为： 牛肉 20.0% 猪肉 9.5% 兔肉 21% 鸡肉 20% 牛乳 3.5% 带鱼 18.0% 大豆 40% 面粉 9.9% 菠菜 2

18、.4% 黄瓜 1.0% 苹果 1.4% 测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。蛋白质分子量的测定方法超离心法凝胶过滤SDSPAGE法光散射法渗透压法蛋白质的定量测定法凯（克）氏(Kjeldahl)定氮法:浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3双缩脲(biuret)法: CuSO4与肽链的氨基结合Folin-Phenol法: 芳香族氨基酸侧链发色紫外法: 280 nm处的紫外吸收 (1 OD280 = 1 mg/ml)Bradford法: 考马斯亮兰 ( Coomassie brilliant

19、 blue G250)与肽链结合后吸收谱变化BCA (bicinchoninic acid)法: FDA唯一认可凯（克）氏定氮法蛋白质的含氮量一般为15-17%，有上下浮动的差别，可以测出总氮(N) = N6.25 = 蛋白质含量 1833年，由Kieldhl提出定氮法，现已发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。常量凯氏定氮法原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨，与硫酸结合成硫酸铵；然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。也可以用过量的

20、标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定。微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：加入硼酸量由50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。微量凯氏定氮蒸馏装置自动凯氏定氮法原理及适用范围同前 特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样品的测定。1.测定范围：0.1-200 m

21、g氮 2.蒸馏时间：3.5分钟/样品（30 mg氮）3.蒸馏能力：40 ml/分钟4.滴定精度：3.8 ul/步，最快40 ml/分钟5.重现性：1%相对误差（包括消化过程）6.回收率：99.5% （1-200 mg 氮）7.数据存储：400个样品8.试管排空：200 ml在2秒内完成9.试剂泵体积：0-150 ml，10 ml/级Kjeltec 2300 自动凯氏定氮仪 丹麦 双缩脲法测定蛋白质含量蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。在一定的实验条件下，

22、未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540-560 nm下比色测定光密度（OD或A），可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。标准蛋白质溶液可以用结晶的牛（或人）血清清蛋白、卵清蛋白或粉末配制。双缩脲法原理：脲（尿素）NH2-CO-NH2 加热至150160时，两分子缩合成双缩脲。双缩脲能与碱性硫酸铜溶液生成紫红（或蓝紫）色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键 CO-NH-，与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定范围内，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量（560 nm） 。NH2-CO-NH-CO-N

23、H2 + NH3NH2-CO-NH2 + NH2-CO-NH2双缩脲的形成及与碱性铜显色Folin-酚法测定蛋白质含量 Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5-100g 蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。也称改良Low

24、ry法。 紫外吸收法测定蛋白质含量大多数蛋白质由于有Trp和Tyr的存在，在紫外280 nm有吸收高峰，以此可以进行蛋白质含量的测定。通常以浓度1 mg蛋白质/ml溶液的A280为1.0进行估算。若已知该蛋白质的文献值，可直接计算出样品溶液中蛋白质的浓度。 蛋白质浓度(mg/m1)=1.45 A280-0.74 A260 (假设1mg蛋白质/ml溶液的A280为1.0)蛋白质含量（mg/ml）=1.55 A280-0.76 A260215 nm和225 nm的吸收差法，蛋白质的肽键在200-250 nm有强的紫外光吸收，其光吸收强弱在一定范围内与浓度成正比，且波长越短光吸收越强。蛋白质浓度(m

25、g/ml)=0.144(A215-A225) (测定范围为20-100g蛋白质/ml)蛋白质紫外吸收定量计算光吸收值 A 的Beer-Lambert公式: A = kcl = log (Io/I) = -log T, T (透过率,%) = I / Io ; k-消光系数，c-摩尔浓度， l-样品池长度; I-光强度 对混合蛋白质样品, 1 OD280nm 1 mg/ml对特定蛋白质的光吸收值的理论值: A280(1 mg/mL) = (5690Nw + 1280Ny + 120 Nc)/M Nw, Ny和Nc分别为Trp、Tyr和Cys的数量, M为分子量Scopes的经验公式: A2051

26、 mg/ml = 27 + 120 (A280/A205)蛋白质也可以下列经验公式定量: Protein concentration(ug/ml) = 144 (A215 -A225)有核酸混入时, 有三种近似计算法: Protein concentration (mg/ml) = 1.55A280 - 0.76A260 Protein concentration (mg/ml) = (A235 -A280)/2.51 Protein concentration (mg/ml) = 0.813A230 - 0.0758A260The Protein Protocols Handbook , b

27、y John M.Walker, Humana Press. BCA法测定蛋白质浓度碱性溶液中，蛋白质将二价铜(Cu2+)还原成一价铜(Cu+ )，后者与测定试剂中BCA bicinchoninic acid，双辛丹宁(金鸡宁)生成一个在562 nm处具有最大光吸收的紫色复合物。复合物的光吸收强度与蛋白质浓度正比。此法测定范围100-1200g蛋白质/ml。BCA法操作简单，灵敏度虽与Folin-酚法相似，但它的试剂十分稳定，因此对时间控制不需那么严格。显色后，1h内读A562值无变化，抗试剂干扰的能力强。考马斯亮兰法测定蛋白浓度 （Bradford法） 1976年由Bradford建立的考马

28、斯亮兰法-Bradford法，根据蛋白质与CBB结合的原理设计。这种测定法具有超过其他几种方法突出的优点，得到广泛的应用。是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。CBB G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。595 nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法测定蛋白质的优缺点优点：（1）灵敏度高，最低蛋白质检测量可达1 ug。（2）快速、简便，只需加一种试剂。（3）干扰物质少。缺点：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳

29、香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 蛋白质的分离纯化蛋白质分离纯化的一般原则纯化蛋白质（酶）的最终目标：增加纯度或比活性，并使产量达到最高值。 前处理 （提取）粗分级 （初提纯）细分级 （精纯化）蛋白质分离纯化的基本原则选择好的材料摸清目的蛋白质的稳

30、定性探索有效的抽提法和浓缩法建立一套层析的组合以较好的方法贮存 初提 精纯化盐析 离子交换层析有机溶剂沉淀 分子筛层析等电点沉淀 疏水/反相层析 结晶 亲和层析蛋白质分离纯化的具体方法必须分离和纯化蛋白质研究蛋白质的性质、功能、氨基酸组成及序列测定，必须制备纯的蛋白质。一个细胞含有成千上万种不同的蛋白质，如何由其中分离获得其中的某个蛋白质？分离纯化蛋白质的方法利用了不同蛋白质分子之间不同的理化性质，如：许多蛋白质能高特异性地与其他生物分子结合，这些蛋白质的分离纯化就可以利用这一特性。破碎细胞及离心蛋白质的来源通常是生物组织或微生物细胞。分离纯化的第一步是要破碎这些细胞，将其中的蛋白质释放到溶液

31、中粗提液(crude extract)。如果需要，可以用不同的离心力对样品进行离心，制备亚细胞组分或分离特定的细胞器。细胞器如核、线粒体、溶酶体等，它们大小不同，离心时的沉降速度不同，在不同的密度梯度中由于不同的比重，浮沉的位置不同。不同的离心可以获得不同的组分。Subcellular Fractionation of TissueFractionationIsopycnic Centrifugation等密度（梯度）离心分部分离 (Fractionation )一旦完成提取物粗抽提或细胞器的制备，多种方法可以用于纯化其中的蛋白质。通常，利用蛋白质的大小或带电特性将混合物中的蛋白质分离成不同的

32、组分分部分离。早期纯化的分部分离利用蛋白质的溶解度的不同，其中涉及pH、温度、盐浓度及其他因素。通常蛋白质在高盐浓度下的溶解度降低盐析(salting out)，在蛋白质溶液中增加盐，可以在一些蛋白质处于溶解时选择性地沉淀一些蛋白质。由于高的水溶性，硫酸铵(NH4)2SO4常被用于这一过程。沉淀蛋白质的方法：盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法重金属盐沉淀法 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 加热变性沉淀法蛋白质混合物的分离方法利用溶解度差别的分离方法根据分子大小不同的分离方法根据电荷不同的分离方法 蛋白质与其它化合物的专一或非专一相互作用利用溶解度差别的分离方法1.等电点沉淀：（isoelectr

33、ic precipitation）2. 蛋白质的盐溶（salting in）和盐析（salting out） 3. 有机溶剂分级法4. 温度对蛋白质溶解度的影响根据分子大小不同的分离方法透析（dialysis）和 超过滤（ultrafiltration）：密度梯度（区带）离心：凝胶过滤层析（分子排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析） （gel filtration，GF） ：透析（Dialysis）含有目的蛋白质的溶液在进一步纯化前需作进一步的处理，如透析，利用蛋白质分子较大的特性将蛋白质从溶剂分离。将部分纯化的蛋白质溶液装置一个半透膜的袋子或管子中，当装有样品的透析袋悬浮于一定离子强度的大体积

34、的缓冲液（透析液）中，半透膜允许盐及缓冲液发生交换，但蛋白质不能透过，这样蛋白质样品被保留在袋或管内，样品中的盐或其它溶质可以透过膜进行动态平衡交换，多次调换透析液可使样品中的多数盐被稀释。常被用于去除蛋白质样品中的硫酸铵脱盐（去盐）。透析（dialysis）超 滤（Ultrafiltration)利用超滤膜在压力下使大分子滞留，而小分子及溶剂滤过的方法叫超滤。超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。超速离心（Ultracentrifugation）不同蛋白质的密度与形态各不相同，在离心力场中沉降的速度也不同，从而将其分离。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数（S）表示。大体上S与蛋

35、白质分子量成正比关系。S与蛋白质的密度和形状相关，如分子量相同，紧密颗粒的摩擦系数小沉降快；而疏松颗粒的摩擦系数大沉降慢。应用：蛋白质的分离纯化和分子量测定。Ultracentrifugation蛋白质的分离与分析-层析(Chromatography)蛋白质分离纯化中常用的层析分子筛层析离子交换层析疏水/反相层析亲和层析物理吸附层析利用分子量差异利用电荷差异利用亲疏性差异利用特异性亲和利用非特异性吸附什么是层析-chromatographyMarch 21, 1903, Meeting of the Warsaw Society of Natural Scientists, Mikhail S

36、emenovich Tswett presented a lecture entitled On a New Category of Adsorption Phenomena and its Application in Biochemical Analysis. Martin & Synge的逆流分配模型K=1/3K=2/3 1952年获奖如阳离子交换层析，固体填料上带负电荷，流动相中带净正电荷的蛋白质与带净负电荷的蛋白质相比流得更慢，前者因为与固定相电荷的作用受到更大的阻滞。两种不同类型的蛋白质可以被分离成明显的两个带。蛋白质样品在流动相中的扩展受到分离蛋白质不同性质的影响及扩散的影响。当

37、柱长增加时，带有不同净电荷的两类蛋白质的分辨率增加。然而柱长增加通常会引起样品流速的降低，样品流经柱的时间长度增加，扩散作用会引起分辨率的下降。离子交换层析离子交换层析原理 分子排阻层析(size-exclusion chromatography)，也称凝胶过滤(gel filtration)，根据蛋白质分子的大小进行分离。柱料是具有特定孔径大小的交联聚合物。由于较大分子的蛋白质不能进入柱料的微孔内部，流经柱的直接路径短，因而比较小分子蛋白质的移动速度快而先被洗脱出来；较小分子的蛋白质进入微孔内部，因相对较长的流经距离而移动得慢而后被洗脱。Gel filtration chromatograp

38、hy亲和层析(affinity chromatography)，根据蛋白质分子的结合特性分离蛋白质。滞留在柱料上的蛋白质是能特异性与柱料表面交联的配体结合的蛋白质。非结合的蛋白质在平衡过程被洗掉，结合到柱上的目的蛋白质用含有游离配体的溶液洗脱下来。亲和层析需要有共价交联在层析填料上的生物配体，交联的配体必需与目标分子间有特异性的亲和结合。非结合分子被洗去后，结合在配体上的生物分子必需是可逆的，被竞争洗脱后保持生物活性。High Performance Liquid Chromatography (HPLC)利用高压泵，加快蛋白质分子沿柱流动的速度，提高层析效果，缩短层析时间，消除扩散影响，提高

39、分辨率。HPLC层析系统泵的结构根据蛋白质表面疏水性的不同，利用蛋白质和疏水层析介质疏水表面可逆的相互作用分离蛋白质。虽然科学文献中有些建议，但到目前为止，还没有被广泛接受的关于疏水相互作用层析机制的理论。疏水相互作用层析（Hydrophobic interaction chromatography, HIC）反相层析（Reverse Phase Chromatography, RPC）依赖于洗脱液中样品分子与介质可逆的相互作用。起始条件主要是水相的，有利于高度有序的水结构围绕着样品分子。通常一小部分有有机修饰，常用3-5%的乙腈来“造成”湿表面。样品结合到填料上，暴露给洗脱液的疏水区域被最小

40、化，分离依赖于样品分子在洗脱液中和填料表面达到的平衡。样品的分布依赖于填料的性质、样品的疏水性和洗脱液的组成（流动相）。纯化工艺中不同层析技术的组合一般准则:结合互补选择性的技术，纯化工艺应尽量采用不同层析技术(e.g. IEX, HIC and GF)减少不同层析技术间的样品处理(e.g. 浓缩, 交换缓冲液)尽量简单附:Classification of Chromatography通常一个特定蛋白质的分离纯化会用到几种不同手段的组合，每种方法的选择也是经验性的，在最终确定最有效的方法前需要进行多种方法及其组合的尝试。一般情况会出现以下不同方法的试验和最终组合。蛋白质的分离与分析-电泳(E

41、lectrophoresis)蛋白质可以通过电泳分离和鉴定分离蛋白质的一个重要技术（手段）是电泳，利用带电蛋白质在电场中受电场力作用发生迁移的特性电泳。电泳通常不用于大规模的蛋白质纯化，因为有更简单的方法可用，并且电泳会不可逆地导致蛋白质结构和功能的改变。电泳在蛋白质及核酸等的分析方法上特别有用。优点是蛋白质经电泳分离后可以显色，研究人员可以很快估测不同蛋白质在混合物中的数量或制备的蛋白质的纯度；电泳还可以用于测定蛋白质的一些性质，如等电点及大概的分子量。蛋白质的电泳通常在交联的多聚物凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）上进行。聚丙烯酰胺凝胶起着分子筛的作用，能减缓电荷/质量比相近蛋白质的迁移。待分离物质

42、的迁移可能还受分子形状的影响。电泳中，驱动大分子运动的力是电势梯度-E（场强）。分子的电泳迁移率等于粒子的电压与电场场强的比值，还等于分子的净电荷Z与摩擦系数f (frictional coefficient)（部分反映蛋白质分子的形状）的比值。 =V/E=Z/f因此，蛋白质在电场中的电泳迁移是大小和形状的作用结果。E. coli RNA Pol.1708年Reuss的实验1930年Tiselius的装置最早的电泳装置-移界(自由)电泳1948年分离血清蛋白的工作获得诺贝尔化学奖，成功将血清蛋白分成5个主要成分-清蛋白、1-、2-、-和-球蛋白。几种常用的电泳纸电泳琼脂电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳S

43、DS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦OFarrell的双向电泳毛细管电泳纸电泳 (Paper Electrophoresis) 在渗透了缓冲液的滤纸上加上电场，使物质移动的电泳法。也就是把样品以带状加在作为支持体的滤纸内来检测其移动和分离的方法。常用以分离性质相似的物质，如各种氨基酸的分离和稀土元素的分离等。纸电泳可分为低压电泳和高压电泳两类。低压电泳的电压一般在100-500 V，电流为 0-150 mA，高压电泳的电压一般在500-10 000 V，50-400 mA。 纸电泳的仪器装置包括电泳槽及电泳仪两大部分。 电泳槽是进行电泳的装置，其中包括铂电极(直径0.5-0.8 cm)、缓冲液槽、

44、电泳介质的支架和一个透明的罩。常见的电泳槽有水平式和悬架式等。电泳仪是提供直流电源的装置，它能控制电压和电流的输出。电泳槽内的铂电极经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连，电源为具有稳压器的直流电源。 琼脂糖凝胶电泳（Agarose Gel Electrophoresis） 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D半乳糖和3,6脱水L半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是13，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交

45、联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。水平式电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE)聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(Acrylamide, Acr)和交联剂N1, N1-甲叉双丙烯酰胺(N, N-methylene bisacrylamide, Bis)在催化剂的作用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交链起来，链纵横交错，形成三维网状结构的凝胶。参与反应的催化剂有二种成分。一是引发剂，它提供原

46、始自由基，通过自由基传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应；二是加速剂，它加快引发剂释放自由基速度。过硫酸铵和核黄素分别引发二种不同类型的反应。单体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺引发剂加速剂引发反应(NH4)2S2O8(NH4)2S2O8核黄素TEMEDDMAPNTEMED化学聚合化学聚合光聚合聚合反应催化剂的搭配TEMED: N, N, N1, N1-tetramethylethylenediamine N,N,N1,N1-四甲基乙二胺DMAPN: 3-dimethylaminpropionitrile，3-二甲基氨丙腈化学聚合：过硫酸铵在TEMED或DMAPN的催化下形成氧自由基，进而使单体

47、形成自由基，引发聚合反应。聚丙烯酰胺凝胺的分离胶(小孔胶)，就是通过这种化学聚合而合成的。光聚合：核黄素在光下形成无色基，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合反应。但过量的氧会阻止链长的增加。此法比上法制得凝胶的胶孔大，因此常作电泳中的浓缩胶。凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系 为了使样品分离得快，操作方便，便于记录结果和保存样本，要求凝胶有一定的物理性质，合适的筛孔、一定的机械强度、良好的透明度。这些性质很大程度上是由凝胶浓度和交联度所决定的。 100 ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数称为凝胶浓度，记号为T。 T (%) Acr (g) + Bis (g) / V (ml) 100%

48、凝胶溶液中，交联剂占单体加交联剂总量的百分数为交联度，记号为C。 C (%) Bis /(Acr + Bis)100%凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系 凝胶浓度能够在3-30%中变化，浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；浓度太小，凝胶稀软，不易操作。凝胶浓度主要影响筛孔的大小，筛孔的平均直径和凝胶浓度的平方根成反比。 T5%，网孔的平均直径为1.55A/5%1/2 33.5 A T7%，网孔的平均直径为1.55A/7%1/2 28.3 A 交联度C反映凝胶结构中甲撑桥的密度。交联过高，凝胶是不透明的，并且缺乏弹性；交联过低，呈糜糊状。交联度可以决定筛孔的最大直径。分子量范围适用的凝胶浓度（%）蛋

49、白质：小于1000010000-4000040000-100000100000-50000075000020-3015-2010-155-152-5核酸：小于1000010000-100000100000-2000000015-205-102-2.6分子量范围与凝胶浓度的关系聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不反应，很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g （1 g）(6)凝胶孔径可调节

50、，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。圆盘电泳(Disc Electrophoresis)正面剖面夹心垂直板电泳槽示意图SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS) 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, 简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS测定蛋白质分子量。 样品和浓

51、缩胶中含 Tris-HCl (pH 6.8), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl (pH 8.8)。系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS (Laemmli, 1970)。 SDS的作用SDS通过疏水作用与蛋白质结合，结合的数量与蛋白质的分子量成比例，一个SDS分子平均结合两个氨基酸残基，使得蛋白质分子带净负电荷，并具有几乎相同的电荷/质量比。SDS结合引起蛋白质构象的改变，SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样

52、的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响。由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。连续系统PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者为好。不连续体系最早由Ornstein(1964) 和Davis(1

53、964) 设计，由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。浓缩效应的原理样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界，而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨

54、酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。（1）样品浓缩效应（a）凝胶孔径不连续性（b）缓冲体系离子成分及pH值的不连续性在pH6.7的凝胶缓冲体系中： 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclclmppmGG (Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根) 有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；（c）电位梯

55、度的不连续性：（2）分子筛效应（3）电荷效应不连续系统浓缩效应示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子；B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。结果处理量出加样端距溴酚蓝前沿间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR:相对迁移率mR= 蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)测定蛋白质的分子量等电聚焦 (Isoelectric focusing, IFE)一种特殊的PAGE电泳法，在凝胶柱中加入两性电解质载体-Ampholine，使凝胶柱上产生

56、pH梯度。当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。蛋白质为两性电解质，所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，聚焦形成一条蛋白质区带。这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。 （等）电聚焦（IEF）：双向电泳(Two-dimensional Electrophoresis

57、, 2-DE)先后结合等电聚焦和SDS-PAFE电泳的技术被称为双向电泳，能使得复杂蛋白质的混合物得到好的分辨。较其他单独使用的电泳分析方法的灵敏度更高。双向电泳能分开不同pI但分子量相同或相近的蛋白质，也能分开相近pI但不同分子量的蛋白质。第一向在圆筒形凝胶进行等电聚焦。再将等电聚焦凝胶平放到平板SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，水平方向反映的是pI差距的电泳，垂直方向反映的是分子量差异的电泳。E. colis ProteinsOFarrell的蛋白质双向电泳银染结果考马斯亮染色为蓝色毛细管电泳 (Capillary Electrophoresis, CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)，是近年来发

58、展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75m内径毛细管柱内用高电压进行电泳分离，创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦, Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988-1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。短短几年内，由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求，得到了迅速的发展。 “CE”统指以高压电场为驱动力, 以毛细管为分离通道, 依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而

59、实现分离的一类液相分离技术。其仪器结构包括一个高压电源, 一根毛细管, 一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。在电解质溶液中, 带电粒子在电场作用下, 以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。 电压：0-30 kV； 分离柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：10-19-10-21 mol/L）高压电源（1）0-30 kV 稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换毛细管柱（1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差。 （2）规格：内径20-75m，外径350-400m；长度=1m检测器要求：极高灵敏度，可柱端检测。检测器、数据采集与计算机数据处理一体化。 类型 检测