dna文库的构建专题知识讲座

1、dna文库的构建专题知识讲座dna文库的构建专题知识讲座第1页掌握：基因组文库构建基础原理和步骤、 cDNA文库构建基础原理和操作技术；熟悉：cDNA 第一链合成、cDNA 第二链合 成； 教学目标dna文库的构建专题知识讲座第2页一、基因文库某一生物个别基因集合叫该生物亚基因组文库。某一生物全部基因集合叫该生物基因文库。dna文库的构建专题知识讲座第3页基因文库（gene library)： 某个生物基因组DNA或cDNA片段与适当载体在体外重组后，转化宿主细胞，并经过一定选择机制筛选后得到大量阳性菌落（或噬菌体），全部菌落或噬菌体集合即为该生物基因文库。外源DNA片断、载体、宿主dna文库

2、的构建专题知识讲座第4页构建基因文库基础程序：（1）提取研究对象基因组DNA,制备适当大小DNA片断，或提取组织或器官mRNA并反转录成cDNA，（2）DNA片段或cDNA与经特殊处理载体连接形成重组DNA，（3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体菌，（4）阳性重组菌落或噬菌斑选择。dna文库的构建专题知识讲座第5页基因文库基因组DNA文库cDNA文库基因组文库与cDNA文库最大区分在于cDNA文库含有时空特异性。dna文库的构建专题知识讲座第6页基因文库应用：构建基因文库目标：筛选出感兴趣目标基因dna文库的构建专题知识讲座第7页二、基因组DNA文库构建（一）基因组DNA文库类型质粒

3、文库， （10kb)噬菌体文库，（0-23kb )粘粒文库， (45kb)人工染色体文库，(又称大片段基因组DNA文库， 100kb1Mb）dna文库的构建专题知识讲座第8页（二）文库代表性和随机性文库代表性：指文库中全部克隆所携带DNA片段能够覆盖整个基因组，也就是说，能够从该文库中分离任何一段基因组DNA。dna文库的构建专题知识讲座第9页一个完整基因组文库应包含克隆数目，Clark和Carbon公式： N=ln（1-p）/ln（1-f）N：代表一个完全基因组文库所应该包含重组克隆个数p：表示所期望目标基因在文库中出现几率f：表示重组克隆平均插入片段大小和基因组 DNA 大小 比值 dna

4、文库的构建专题知识讲座第10页例：哺乳动物基因组：3109 Kb p：=99% 平均插入片段大小20kb f= 20Kb/3109 KbN=ln（1-p）/ln（1-f）=690773.2dna文库的构建专题知识讲座第11页（三）、基因组DNA文库构建流程dna文库的构建专题知识讲座第12页 载体制备； 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）提取； HMW DNA 个别酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size selection）； 载体与外源片段连接与转化或侵染宿主细胞； 重组克隆挑取和保留。 基因组 DNA 文库构建程序包含

5、 5 个个别：dna文库的构建专题知识讲座第13页1基因组 DNA 文库载体制备 载体制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。2高质量大分子量基因组 DNA 提取和个别酶切 构建不一样大小插入片段基因组文库对 DNA 质量要求不一样，普通所提取 DNA 分子量最少应该是文库最终平均插入片段长度 35 倍。实践表明，提取基因组 DNA 分子量越大，所得到重组克隆插入片段越大。 dna文库的构建专题知识讲座第14页寻找最适载体与基因组之间百分比。首先最好选择转化效率高进口感受态细胞或效价高且质量稳定包装蛋白，对于电转化而言，选择适当转化电压对不一样插入片段 DNA 转化效率也有所不一样。3文库连

6、接转化或包装侵染dna文库的构建专题知识讲座第15页4文库质量检测克隆数越多，平均插入片段越长，插入效率和基因组覆盖度越高，文库质量就越好。普通覆盖倍数到达4-6倍覆盖率。dna文库的构建专题知识讲座第16页 指文库对象不是全基因组范围，而是基因组某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段组合，一条染色体或更小区段（如一个YAC或BAC克隆等）。（四）、亚基因组文库dna文库的构建专题知识讲座第17页比如：将基因组DNA用各种限制性内切酶切割，Southern杂交显示目标基因在8.3kbSpel片段上则可将Spel酶切基因组DNA中8.3kb片断回收，用于构建DNA文库。dna文库的构建专题知识讲

7、座第18页三、cDNA文库构建1、cDNA文库特征1）基因表示时空性决定cDNA文库取材， 构建cDNA文库时最好选取目标基因表示量最高 发育时期或这一时期特殊组织。dna文库的构建专题知识讲座第19页 根 叶 花 花药 茎 穗下节 幼胚GAmybdna文库的构建专题知识讲座第20页2）表示量差异决定构建cDNA文库要含有适当容量。3)mRNA丰度高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总mRNA22% 中等丰度mRNA：200-300个拷贝，占总mRNA49%低丰度mRNA：1-15个拷贝，占总mRNA29%dna文库的构建专题知识讲座第21页2、均一化cDNA文库 经过一定策略和方法，将构建好

8、独立cDNA文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度基因在cDNA文库中百分比，从而使高丰度、中等丰度和低丰度基因在文库中出现频率相对一致，这种cDNA文库称均一化cDNA文库。dna文库的构建专题知识讲座第22页3、cDNA文库构建 第一，细胞总 RNA 提取和 mRNA 分离；第二，第一链 cDNA 合成；第三，第二链 cDNA 合成；第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体 并导入宿主中繁殖。 dna文库的构建专题知识讲座第23页插dna文库的构建专题知识讲座第24页1）mRNA完整性及mRNA富集 通常是依据28sRNA和18sRNA条带亮度判断RNA完整性，间接判断mRNA完整性。

9、 假如电泳观察到28SrRNA条带亮度约为18SrRNA条带亮度两倍，说明RNA样品完整，降解不多，假如两条带亮度反过来，说明个别28SrRNA已降解；如无清楚条带，表明样品己严重降解。 mRNA富集对低丰度mRNA显得尤其主要。dna文库的构建专题知识讲座第25页2）第一链 cDNA 合成由mRNA到cDNA过程称反转录，由反转录酶催化。反转录酶：依赖RNA DNA聚合酶，需要引物反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产生完整cDNA)dna文库的构建专题知识讲座第26页3)第二链cDNA合成 氢氧化钠消化杂合双链中 mRNA 链 第一链 cDNA 3-末端就会形成一个发夹环 合

10、成第二链cDNA S1 核酸酶消化连接处 本身引导法合成cDNA第二链dna文库的构建专题知识讲座第27页dna文库的构建专题知识讲座第28页常见方法dna文库的构建专题知识讲座第29页1）它是以cDNA第一条链为模板，设计并合成一组引物，经过PCR扩增取得多拷贝双链cDNA,因为其放大高度灵敏性，PCR合成法能利用非常有限生物材料构建cDNA文库，尤其适合低拷贝mRNA克隆。2）同时，可用总mRNA作为合成cDNA第一链模板，不用纯化mRNA，所以防止了纯化过程中一些信息分子丢失。3）PCR合成cDNA第二链是经过在第一链3端同聚物加尾方法实现，不会丢失其末端最终几个核苷酸，所以轻易得到完整

11、cDNA。PCR合成法是构建cDNA文库一个新策略，已得到广泛应用。优点：dna文库的构建专题知识讲座第30页4、双链cDNA分级分离 连接前回收大于500bpcDNA用于连接。去掉引物、街头及反转录产生各种不完整cDNA链，提升文库质量。dna文库的构建专题知识讲座第31页5、双链cDNA与载体连接1）同聚物加尾：2）加接头引入酶切位点，添加带有限制性酶切位点接头是最常见方法3）cDNA定向插入：cDNA两端添加不一样限制性酶切位点，双酶切后与对应双酶切载体连接dna文库的构建专题知识讲座第32页末端转移酶+dCTP末端转移酶+dGTP载体和cDNA退火同聚物加尾法：dna文库的构建专题知识

12、讲座第33页CH3CH3CH3CH3CH3CH3接头加接头dna文库的构建专题知识讲座第34页cDNA定向插入 dna文库的构建专题知识讲座第35页6、cDNA文库载体选择 普通cDNA长度范围多在0.5-8kb之间，所以不用考虑外源片段长度。质粒载体或噬菌体载体dna文库的构建专题知识讲座第36页7、cDNA文库均一化处理均一化cDNA文库：是指某一特定组织或细胞全部表示基因均包含其中，且在 cDNA 文库中表示基因对应 cDNA 拷贝数相等或靠近。 dna文库的构建专题知识讲座第37页 均一化 cDNA 文库是克服因为基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍有效办法，有利于研究基因表

13、示和序列分析。 dna文库的构建专题知识讲座第38页构建均一化cDNA文库主要有两种路径：基因组DNA饱和杂交法基于复性动力学原理均一化学法dna文库的构建专题知识讲座第39页基因组DNA饱和杂交法理论基础：不一样表示水平基因对应基因组拷贝数相对一致。dna文库的构建专题知识讲座第40页步骤：1）基因组DNA酶切、固定2）基因组DNA变性成单链3）分离纯化cDNA文库混合质粒4）文库DNA与固定基因组DNA充分饱和杂交，固定对应cDNA,5) 洗脱cDNA并重新转化受体菌。dna文库的构建专题知识讲座第41页限制：因为基因组复杂性，极难取得覆盖基因组 单链DNA 片段，造成文库内基因丢失。 d

14、na文库的构建专题知识讲座第42页理论基础：复性动力学原理 cDNA文库中高丰度cDNA复性所需时间较短，低丰度cDNA复性所需时间较长，经过控制复性时间可使高丰度cDNA复性成双链状态，而低丰度cDNA仍保持单链状态，分离单链cDNA，转化宿主细胞，即可得到均一化cDNA文库。基于复性动力学原理均一化方法dna文库的构建专题知识讲座第43页四、基因克隆筛选策略1、表型筛选： 在宿主菌中表示目标基因，使宿主产生新表型或使宿主恢复其突变基因表型来筛选目标基因。dna文库的构建专题知识讲座第44页(1)抗药性筛选:这是利用载体DNA分子上抗药性选择标识进行筛选方法。dna文库的构建专题知识讲座第4

15、5页(2)插入失活筛选法dna文库的构建专题知识讲座第46页(3)显色反应选择法(-互补法) 将含有-半乳糖苷酶基因（LacZ）调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列质粒转化至可编码-半乳糖苷酶羧基端（C端）个别序列宿主细胞中，可使各自无活性片段实现互补，融为一体，产生含有酶学活性蛋白，从而使转化宿主菌在含有IPTG/X-gal(异丙基-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-D-硫代半乳糖苷)培养基上产生蓝色菌落，这种现象就称为-互补。dna文库的构建专题知识讲座第47页2、PCR筛选法主混合池行混合池列混合池分别PCR扩增dna文库的构建专题知识讲座第48页引物：1）同源引物

16、邻近种属对应基因2）依据氨基酸序列设计简并 引物dna文库的构建专题知识讲座第49页3、菌落原位杂交法探针：1）同源DNA探针 邻近种属对应基因2）依据氨基酸序列设计简并 探针dna文库的构建专题知识讲座第50页dna文库的构建专题知识讲座第51页4、免疫筛选需制备目标基因产物抗体进行筛选。dna文库的构建专题知识讲座第52页5、酵母双杂交系统经典真核生物转录因子（如GAL4）含有两个不一样结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上特异序列， 并使转录激活结构域定位于所

17、调整基因上游， 转录激活结构域可同转录复合体其它成份作用，开启它所调整基因转录。 二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍含有各自功效。而且不一样两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因经过激活报道基因表示探测蛋白蛋白相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain载体; b 含DNA-activating domain载体。 dna文库的构建专题知识讲座第53页dna文库的构建专题知识讲座第54页限制性核酸内切酶分析Southern杂交体外表示蛋白DNA序列分析，最准确和可靠判定方法五、克隆基因验证和分析dna文库的构建专题知识讲座第55页依据载体

18、选择保留文库方法文库阵列法（无菌培养板）保留大片段DNA文库长久保留需在-80下进行防止文库重复冻溶六、DNA文库保留dna文库的构建专题知识讲座第56页基因组DNA文库与cDNA文库比较dna文库的构建专题知识讲座第57页1）cDNA文库所包含遗传信息要远远少于基因组DNA文库，而且受细胞起源或发育时期影响。2）cDNA文库虽能反应mRNA分子结构和功效信息，但不能直接取得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列结构与功效方面信息。3）在cDNA文库中，对应于高丰度mRNAcDNA克隆所占百分比比较高，分离起来比较轻易，而对应于低丰度mRNAcDNA克隆所占百分比则比较低，所以分离也就比较困难。 dna文库的构建专题知识讲座第58页七、目标基因克隆 基因工程或DNA重组技术前提条件是从生物体基因组中分离克隆目标基因。目标基因取得之后，或确定其表示调控机制和生物学功效，或建立高效表示系统，构建含有经济价值基因工程菌（细胞），或将目标基因在体外进行必要结构功效修饰，然后输回细胞内改良生物体遗传性状，包含人体基因治疗。dna文库的构建专题知识