关于研究蛋白质细胞定位的几种方法

1、关于研究蛋白质细胞定位几个方法姓名：甄萍萍导师：梁建生第1页导言 真核细胞含有复杂亚细胞结构，已发觉数十种细胞器，每种细胞器都有一组特定蛋白。真核细胞除叶绿体，线粒体能少许合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或粗糙内质网合成，最终运输到不一样地点，形成成熟蛋白并行使功效。转译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信号，可引导蛋白在胞内定位。蛋白质在细胞内定位问题，是细胞生物学研究中心问题，也是分子生物学研究热门话题。当前，这方面工作己取得很人进展。细胞器不一样，对应靶向蛋白定位过程也不一样。第2页研究蛋白亚细胞定位主要几个方法 免疫荧光技术 免疫胶体金标识 与gfp构建融合基因，

2、用荧光显微镜观察 第3页免疫荧光技术 依据抗原与抗体反应得原理，先将已知抗原或抗体标识上荧光素制成荧光标识物荧光标识物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检验细胞或组织内对应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成抗原或抗体复合物上含有各种颜色荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激光照射而发出各种颜色荧光，能够看见荧光所在细胞或组织，从而确定抗原或抗体性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 S. pagny等()将XYIT36: GFP转入拟南芥，检测发觉荧光出现在高尔基体。使用植物Lewis(高尔基体标志分子)抗体以及BIP(内质网标志分子)抗体进行免疫荧光标识，发觉GFP绿色荧光与使用L

3、ewis抗体所做免疫荧光存在共定位，而与BIP分布在不一样部位。说明XYIT36: GFP定位在高尔基体。 第4页免疫胶体金标识 金标法是Faulk和Taylor（1971）提出，并首先用于免疫电镜。当用金标识抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液展现鲜艳樱红色，不需加外进行染色。在电镜水平，金颗粒含有很高电子密度，清楚可辨。 免疫胶体金标识电镜技术广泛应用于细胞及组织内蛋白定位研究，金标法是利用胶体金在碱性环境中带负电性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标识。电镜水平免疫金染色是当前较理想免疫定位方法，含有特异性强、灵敏度高、定位准确和含有双重标识功效等优点。比如用连有15nm金颗粒GFP单克隆抗

4、体以及连有lOnm金颗粒过氧物酶体标志酶抗体作为一抗进行免役金标，证实CAT1-GFP定位在过氧物酶体(Akane Kamigaki eta1.,)。第5页GFP及其在生命科学研究中应用 介绍GFP 海洋生物发光是个非常普遍现象。从原生生物到脊椎动物都有生物发光，如海萤，磷虾，腔肠动物等。从不一样动物体内提取荧光蛋白结构、性质不尽相同，不一样动物荧光发生机制有很大差异。多管水母体内存在两种发光蛋白绿色荧光蛋白:GFP和aequorin。当aequorin与3个Ca2+结合后，即发生氧化反应并发射蓝光，最大发射波长469nm。 GFP被紫外光或蓝光激发后发出绿色荧光(Morise, H.，Shi

5、momura,1974)。 第6页GFP在水母体内发光机制以下：第7页 GFP荧光产生主要归功于分子内第65, 66, 67位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团功效。翻译出蛋白折叠环化后，在O2存在下分子内第67位甘氨酸酰基对第65位丝氨酸羧基亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸。a-键脱氢反应之后，造成芳香团与咪唑基结合。这么GFP分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团，该过程可自动催化合成(Heim R,Douglas CP.,1994) 第8页GFP晶体结构(如图)显示： 蛋白中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm,宽240nm，由11个围绕中心a螺旋反平行折叠组成，荧光基团形成

6、是从这个螺旋开始，桶顶部由3个短垂直片段覆盖，底部由1个短垂直片段覆盖，生色团位于大空腔内(CubittAB, 1999)。第9页 GFP在生命科学研究中应用 GFP虽能自发荧光，但野生型GFP荧光较弱。为了改进GFP荧光特征，对GFP进行了突变和重组试验。Pang等取得GFP突变型比野生型亮度增强20倍;Tian等发觉野生型GFP是低水平表示，而改良后GFP表示量增加100倍。Cormack等取得三位点替换突变体荧光强度比野生型高100倍，而且在自然光下就能观察到绿色荧光，使得gfp作为汇报基因更为灵敏和快速。Confocal能有效消除同一焦平面上非检测点杂散荧光和非焦平面荧光干扰，使分辨率

7、提升，取得清楚图象，而且它含有逐层扫描功效，可对组织细胞进行无损伤系列光学切片。Confocal应用更有利于GFP在生物学研究中应用。 第10页原理 应用DNA亚克隆技术，将目标基因与GFP基因组成融合基因，经过愈伤组织转化法、基因枪、显微注射、电激转化等方法转化适当细胞，利用目标基因基因表示调控机制，如开启子和信号序列来控制融合基因表示，在荧光显微观察系统下监测融合蛋白在细胞内存在状态。目基因融合基因gfp转化表示荧光显微观察第11页 细胞器研究 在植物发育过程中能够利用GFP直接观察生活细胞中线粒体数目、分配和运动。将GFP与某一导肽序列融合可将GFP定位到特定细胞器和膜系统中，然后对其进

8、行活体观察来研究不一样细胞器动态、功效以及内膜系统。 如将GFP和内质网定位信号KDEL构建成融合蛋白，结果在转化细胞内质网中观察到膜皮层样网状结构(Scotta, Wyatts, 1999)。此标识物也促进了内膜系统结构、功效和囊泡运输研究。还可用GFP光谱突变体如蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白来研究不一样植物细胞骨架组分之间相互作用，在动物和酵母中，GFP与肌动蛋白、微管蛋白以及其它细胞骨架作用蛋白融合，成功研究了细胞骨架力学(Westphal et al., 1997; Schafer et al., 1998; Smith )。第12页 蛋白质研究 将GFP作为荧光探针，与要

9、研究蛋白质融合在一起，进行活细胞内蛋白质分布与改变研究。此方法在过去几年中对细胞生物学观察有着显著影响。 水稻CaM类蛋白OsCaM61，含有N一端CaM区域，C端有异戊二烯化位点。将OsCaM61与GFP融合起来，研究其亚细胞定位，发觉GFP- OsCaM61融合蛋白是膜结合，而OsCaM61-GFP却主要在核质。用mevinolin处理细胞，阻止类异戊二烯合成，引发GFP- OsCaM61运输到核质。前者C端异戊二烯化位点被掩盖而后者位点是活跃。此蛋白异戊二烯化状态对于细胞定位起决定性作用。亚细胞定位依赖于蛋白异戊二烯化状态，表明在不一样生理条件下，这种类CaM可能经过结合到定位于不一样细

10、胞成份靶子上，起到不一样功效作用(Aiwa Dong et a1.,)第13页 A、B:仅转入GFPC、D:转入PF40-GFP融合蛋白第14页 用GFP还能够用于基因缄默、开启子活性、细胞信号转导和细胞局部区域pH、内生菌和植物相互作用研究等。GFP在动物学研究方面应用也非常广泛(比如用于研究肿瘤发生机制、转移机制、基因治疗等)。 gfp用作汇报基因有众多优点：1灵敏度高，易检测而且是活体检测，对细胞组织不具破坏性。而当选取gus作汇报基因时，在组织学检测时，一定程度上含有破坏性。因为要对材料进行固定，保温和脱色，而且植物中存在GUS本底，影响检测准确性；2在活体内表示不受生物类型、基因型、

11、细胞和组织类型限制；3不需任何底物和外源辅因子参加；4便于早期筛选转基因材料。 GFP在生物学研究中应用广泛，有很大优越性，但也存在一定问题。GFP检测受背景荧光和光漂白现象限制，它过量表示对细胞是有毒，转化细胞再生能力下降。试验中极难建成GFP稳定细胞株，可能与GFP参加细胞凋亡相关。 第15页参考文件：1. Akane Kamigaki. Identification of peroxisomal targeting signal of pumpkin catalase and the binding analysis with PTS1 receotor. Plant Journa1., 33:161-1752. Scott A, Wyatt S, TsouP L, et al. Model system for plant cell biology; GFP imaging in living onion epidermal cells. Biotechniques, 1999, 26: 1125-11323. S.Pagny. S