Westernblotting蛋白免疫印迹实验

1、蛋白免疫印迹（Western Blot）生物试验培训系列之三第1页 WB基础一目 录2 试验步骤与结果分析三 试验室常见问题解答四 试剂与设备二第2页目 录31.WB概念2.WB应用3.WB原理4.WB特点 WB基础一 试验步骤与结果分析三 试验室常见问题解答四 试剂与设备二第3页1.1 蛋白免疫印迹概念是将电泳分离后总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原一个蛋白质检测技术。4第4页1.2 蛋白免疫印迹应用基因在蛋白水平表示研究例： 吴德平,王颖等.立氏立克次体蛋白抗原基因表示和重组蛋白抗原 免疫印迹分析J.中国人兽共患病学报,25(10):931-

2、934.抗体活性检测例：胡纪文，马东礼.免疫印迹法检测血清幽门螺杆菌抗体应用价值J. 热带医学杂志,13(8):952-956.疾病早期诊疗例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊疗中应用J. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.5第5页1.2 蛋白免疫印迹应用检测样品中特异性蛋白质是否存在例：李桂波.利用免疫印迹法钓取PC3M细胞中与人前列腺癌高转移相关特异性短肽结合蛋白研究D.吉林:吉林大学,.对特异性蛋白质进行半定量分析例：6第6页1.3 WB原理WB采取是聚丙烯酰氨凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标识二抗。经过特异

3、性抗体对凝胶电泳处理过蛋白质进行着色。经过分析着色位置和着色深度取得特定蛋白质在所分析细胞或组织中表示情况信息。7第7页1.4 WB特点WB是在蛋白质电泳分离和抗原、抗体检测基础上发展起来检测蛋白质技术SDS凝胶电泳：高分辨率抗原抗体反应：特异性转膜：灵敏度8第8页目 录91.试剂2.耗材3.设备 WB基础一 试验步骤与结果分析三 试验室常见问题解答四 试剂与设备二第9页2.1 试剂甲叉双丙烯酰胺TrisHCLSDS10第10页丙烯酰胺过硫酸铵TEMED2.1 试剂11第11页RIPA裂解液SDSloading Buffer封闭液ECL显影液2.1 试剂12第12页2.1 试剂配置聚丙烯酰胺储

4、存液： 29g丙稀酰胺、1gN,N-亚甲叉双丙稀酰胺 、加 H2O至 100mL。注意事项:应以温热去离子水配制储于棕色瓶，4避光保留。严格核实pH不得超出7.0，因光催化或碱催化能够发生脱氨基反应。使用期不得超出两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，能够过滤。13第13页2.1 试剂配置分离胶缓冲液(1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8): 18.15gTris和48mL1mol/LHCL 混合加水稀释到100mL终体积。浓缩胶缓冲液(0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8): 6.05gTris溶于40mLH2O中，用约48mL1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到1

5、00mL终体积。注意事项:过滤后4保留。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调整pH值，而不用 Tris-HCL。 转移缓冲液： 2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS，并加入200mL甲醇，加水至总量1L。14第14页2.1 试剂配置SDS蛋白上样缓冲液: pH6.80.5mol/LTris缓冲液8mL，甘油6.4mL，10%SDS 12.8mL，巯基乙醇3.2mL，0.05%溴酚蓝1.6mL，H2O32mL混匀备用。按1:1或1:2百分比与蛋白质样品混合，沸水煮3min，混匀后再上样，普通为 20-25L，总蛋白量100g。Tris缓冲盐溶液(TBS): 20mmo

6、l/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。Tris-甘氨酸电泳缓冲液: 30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000mL，临用前稀释 10 倍。15第15页2.2 耗材移液枪/枪头滤纸蓝盖玻璃瓶量筒容量瓶离心管烧杯96孔板PVDF 膜海绵垫16第16页2.3 设备垂直电泳仪化学发光成像系统台式离心机17第17页2.3 设备高压灭菌锅电子天平电热恒温鼓风干燥箱18第18页2.3 设备磁力搅拌器4、-20冰箱19第19页目 录201.试验步骤2.结果分析3.注意事项 WB基础一 试验步骤与结果分析三 试验室常见问题解答四 试剂与设备二第20页3.

7、1 试验步骤蛋白样品制备蛋白含量测定21第21页3.1.1 蛋白样品制备在六孔板中，按照一个孔添加150L百分比添加适量RIPA裂解液，用枪吹打均匀以充分接触细胞。样品放置冰上30min（中间混匀5-6次）直至裂解完全。充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续PAGE、Western和免疫沉淀等操作22裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150L裂解液，若细胞密度非常高能够适当加大裂解液用量至200L或250L。第22页a).配制BCA工作液：依据标准品和样品数量，按50体积试剂A,1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。b).将标准品、待测样品和工作液按

8、下表加入到96孔板中，混匀。23管号试剂(L)空白管标准管测定管213233x3435363蛋白质标准液(1mg/mL)01246810蒸馏水(L)10986420待测样(L)10BCA工作液(L)2002002002002002002002003.1.2 蛋白含量测定第23页3.1.2 蛋白含量测定c).混匀后，在37烘箱中温浴30min，冷却至室温。d).酶标仪562nm波长下测定吸光度。e).以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。f).用测定孔平均光吸收值在标准曲线上查出对应蛋白质含量。24第24页3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳所带负电荷大大超出了蛋白质分子原有电荷量，从而

9、消除了不一样分子之间原有电荷差异。25上样缓冲液作用SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质二级和三级结构在强还原剂（-巯基乙醇）作用下，使半胱氨酸之间二硫键断裂蛋白质(SDS-蛋白质复合物)-第25页3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳PAGE胶聚合原理：甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸铵作用下聚合，形成胶。分子筛效应26第26页清洗玻璃板配胶上样电泳停顿电泳27玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶配分离胶，加入TEMED后马上摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置时即可。然后胶上加一层水，液封后胶凝更加快。（加水液封时要很慢，不然胶会被冲变型。）当水和胶之间有一条折射线时，说

10、明胶已凝了。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入TEMED后马上摇匀即可灌胶。将剩下空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子两边竖直向上轻轻将其拨出。（插梳子时要使梳子保持水平。）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字一面面向外。）3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳第27页清洗玻璃板配胶上样电泳停顿电泳28测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白溶液体积即为上样量。适量蛋白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100水中煮5min使蛋白变性。放置冰上3min，离心15min

11、，13000rpm，4。加足够1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液最少要漫过内测小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸收样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中迟缓加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。）3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳第28页清洗玻璃板配胶上样电泳停顿电泳浓缩胶80V电压跑20分钟，可多跑几分钟；分离胶180V电压跑至底端。纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在Marker下方切角做标识，将胶泡在清水中。293.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳第29页3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳30清洗玻璃板配胶上样电泳停顿电泳第30页3.1.4 转膜剪PVD

12、F膜，并提前切个角，甲醇中泡约30秒，在放入蒸馏水中2min。将膜、海绵、滤纸一起泡入1*转膜液中，平衡最少5min。（转膜液可回收）打开电转印夹，在黑色面一次放入海绵垫、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵垫31转膜条件：45V，1.5h第31页3.1.5 封闭用1TBS漂洗一次。加入封闭缓冲液,置于振荡培养箱中进行封闭(26,80rpm/min, 2-4h)。32第32页3.1.6 一抗杂交弃封闭液，加入用Western一抗稀释液稀释一抗杂交溶液, 置于4杂交过夜或在振荡培养箱中进行杂交(26,80rpm/min,1h)33第33页3.1.7 二抗杂交回收一抗杂交液，用TBST洗膜3

13、次(置于振荡培养箱中,26,80rpm/min,10min/每次)弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释二抗杂交溶液,置于振荡培养箱中进行杂交(26,80rpm/min,1h); 34第34页WB显色分类放射自显影底物化学发光ECL底物荧光ECF底物 呈色DAB35第35页放射自显影原理：利用放射性核素发射射线，使感光材料中卤化银等感光，显出影像后进行放射性标识物定位和定量测量技术。特点：灵敏度高、分辨率好、保留时间长久，但因为试验所用方式性物质对人体有辐射作用。应用：多用于研究标识化合物在机体、组织和细胞中分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。第36页底物化学发光ECL原理:化学

14、发光是在一些特殊化学反应中吸收了反应释放化学能,而处于电子激发态反应中间体或反应产物由激发态回到基态时所产生一个光辐射,化学发光分析是依据化学反应产物光辐射(化学发光)确定物质含量一个痕量分析方法。特点:灵敏度高和线性范围宽，不需要任何光源。第37页底物荧光ECF原理：是利用荧光染料（如Cy2 ,Cy3, Cy5）标识二抗，标识荧光染料二抗分别对应对应目标蛋白，以此实现经过检测荧光染料信号强度，实现种蛋白信号检测，以进行准确定量分析。荧光检测Western Blot原来不是检测主流方法，不过荧光法检测允许在同一张转印膜上用不一样颜色荧光底物同时检测不一样目标。第38页底物DAB呈色原理：二氨基

15、联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）是辣根过氧化物酶最敏感、最惯用显色底物，反应产物因不溶于水、二甲苯和醇棕色沉淀物而被广泛地用于蛋白印迹（Western Blot,WB)、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)、斑点印迹(Dot blot)和生物芯片(Biochip)等染色和显色反应。用之进行对底物显色即被称为底物DAB呈色法。此技术成本低，操作也较简单是惯用western blot成像分析技术之一，不过因为其灵敏度稍低，在目标蛋白表示量较少情况下可能没有理想结果应慎用。第39页3.1.8

16、 显影检测弃二抗溶液，用TBST洗膜3次（置于振荡培养箱中，26， 80rpm/min, 10min/每次）；ECL工作液配制：等体积混合Detection reagent 1和Detection reagent 2，现配现用。依据膜大小，按每10平方厘米膜加1mL ECL工作液，滴加ECL工作液工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置1分钟。 利用化学发光系统采集图像和进行图像分析。40第40页3.2 结果分析41第41页3.3 注意事项42电泳结束后，应及时用清洗洁净玻璃板，清洗时应使用海绵擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板；并及时冲洗电泳槽，以免盐离子沉积，造成电泳丝腐蚀；注意海绵

17、垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶叠放位置，以确保正确转印方向；注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶相对大小，以免造成短路；转印结束后，应及时取出转印膜，并马上用TBST漂洗1-2遍，并马上加入封闭液，这么能够防止膜上杂质残留或膜变干造成背景高问题；第42页 WB基础一目 录43 试验步骤与结果分析三 试验室常见问题解答四 试剂与设备二第43页常见问题解答没信号膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品也无条带：试验失败？抗体失效？重新进行试验，重新稀释抗体；膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品有条带：试验样品降解？试验样品无该蛋白表示？转膜效率过低？重新进行试验，复核查找上述原因，以

18、寻找对策。背景过高目标条带以外区域有信号，假如是片状，甚至整块膜，普通是封闭不好，膜变干，一抗非特异杂交或二抗非特异杂交造成；假如是条纹状，普通是因为膜上有压痕造成，假如是点状，普通是膜上有杂质，或泡膜时膜没有充分浸泡；转膜效率过低。44第44页常见问题解答一抗效价低：提升一抗稀释百分比，提升杂交时间，降低洗膜次数，提升曝光时间，提升上样量；转膜效率低：检测转膜试剂和耗材，优化转膜条件；在目标带以外信号条带为杂带，普通因为一抗特异性不好所造成，假如目标带比杂带信号强，可经过减低一抗稀释百分比，并缩短杂交时间处理；假如目标带比杂带信号弱，在不减低一抗稀释百分比前提下，缩短杂交时间；并提升TBST

19、缓冲液NaCl浓度提升到500nM；杂带假如与目标带位置相距较远，能够不优化试验，直接裁剪即可，杂带假如与目标带位置相距较进，应调整胶浓度，并延长电泳时间。有杂带目带弱45第45页两块玻璃板之间灌胶,胶为何总是不平?46玻璃未洗净过硫酸铵和TEMED加量过多可造成胶凝固过快而使胶不平加入试剂后未摇匀，造成局部聚合剂浓度过高，聚合较快而使胶不平加入不均匀，应注意手法灌胶后应进行压胶(可用水或正丁醇)温度会影响胶聚合，若受热不均匀，也会影响胶聚合不均匀。第46页为何会有“微笑”和“倒微笑”这么效果呢？47 微笑是因为灌胶时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，造成凝胶中分子有不一样迁移率所致。这种情况在

20、较厚凝胶以及垂直电泳时经常发生。 “倒微笑“也称“皱眉”现象经常是因为垂直电泳时电泳槽装置不适当引发，尤其是当凝胶和玻璃板组成三明治底部有气泡或靠近隔片凝胶聚合不完全便会产生这种现象；中间部分和两端受热不一样而致成了“倒微笑”可能是因为两端胶凝不好，加APS和TEMED后应该混合均匀。第47页Western-blot制胶时好多泡泡怎么办？48玻璃板需用洗洁精洗后再用双蒸水冲洗，晾干配胶时应沿管壁缓缓加入各成份，用手轻轻摇匀；若用枪头吹打需迟缓且不要打到头倒胶时，用枪沿一侧缓缓加入，不要打到底，以免带入气泡封胶时，可用200L枪加水，减小压力，以免把胶冲起室温制胶时，因为温差及凝胶聚合反应放热可

21、产生气泡分离胶凝好后，倒掉里面水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，快速插梳子第48页问答时间49第49页WB标准试验-试剂耗材与设备试剂：SDSRIPA裂解液丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺TEMEDECL显影液封闭液TrisHCL过硫酸铵SDSloading Buffer50耗材：离心管烧杯96孔板PVDF 膜海绵垫移液枪/枪头滤纸蓝盖玻璃瓶量筒容量瓶设备：台式离心机化学发光成像系统垂直电泳仪电热恒温鼓风干燥箱电子天平高压灭菌锅磁力搅拌器4、-20冰箱第50页WB标准试验-试剂配置聚丙烯酰胺储存液： 29g丙稀酰胺、1gN,N-亚甲叉双丙稀酰胺 、加 H2O至 100ml。分离胶缓冲液(1.5mmol/LT

22、ris-HCL(pH8.8): 18.15gTris和48mL1mol/LHCL 混合加水稀释到100mL终体积。浓缩胶缓冲液(0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8): 6.05gTris溶于40mLH2O中，用约48mL1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100mL终体积。转移缓冲液： 2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS，并加入200mL 甲醇，加水至总量 1L。51第51页SDS蛋白上样缓冲液: pH6.80.5mol/LTris缓冲液8mL，甘油6.4mL，10%SDS 12.8mL，巯基乙醇3.2mL，0.05%溴酚蓝1.6mL，H2O32mL混匀备用

23、。按1:1或1:2百分比与蛋白质样品混合，沸水煮3min，混匀后再上样，普通为 20-25L，总蛋白量100g。Tris缓冲盐溶液(TBS): 20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。10 xTris-甘氨酸电泳缓冲液: 30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000mL。 临用前稀释 10 倍。52WB标准试验-试剂配置第52页WB标准试验流程在六孔板中，按照一个孔添加150L百分比添加适量RIPA裂解液，用枪吹打均匀以充分接触细胞。样品放置冰上30min（中间混匀5-6次）直至裂解完全。充分裂解后，10000-14000g离心3

24、-5分钟，取上清，即可进行后续PAGE、Western和免疫沉淀等操作53样品制备第53页WB标准试验流程54含量测定管号试剂(L)空白管标准管测定管213233x3435363蛋白质标准液(1mg/ml)01246810蒸馏水(L)10986420待测样(L)10BCA工作液(L)200200200200200200200200配制BCA工作液：依据标准品和样品数量，按50体积试剂A,1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。将标准品、待测样品和工作液按表1加入到96孔板中，混匀。在37烘箱中温浴30min，冷却至室温。酶标仪562nm波长下测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐

25、标绘制标准曲线。用测定孔平均光吸收值在标准曲线上查出对应蛋白质含量第54页清洗玻璃板配胶上样电泳玻璃板对齐放入夹中卡紧，垂直卡在架子上准备灌胶配分离胶，加入TEMED马上摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置，胶上加一层水，液封后胶凝更加快。（加水液封时要很慢，不然胶会被冲变形）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入TEMED后马上摇匀即可灌胶。将剩下空间灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子两边竖直向上轻轻将其拔出。（插梳子时要使梳子保持水平）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外

26、。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字一面面向外。）测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白溶液体积即为上样量。适量蛋白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100水中煮5min使蛋白变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4。加足够1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液最少要漫过内测小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸收样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中迟缓加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。）停顿电泳浓缩胶80V电压跑20分钟，可多跑几分钟；分离胶180V电压跑至底端。纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在Marker下方切角做标识，将胶