7-受体细胞与转化

1、 (1)受体细胞 (2)重组DNA分子转入受体细胞 (3)重组子的筛选目的基因导入受体细胞 1第1节 受体细胞受体细胞(receptor cell)：概念：能摄取外源DNA并使其在体内稳定维持的有应用价值和理论研究价值的细胞。也称“宿主细胞”或“寄主细胞 (host cell)”。细胞功能：能摄取外源DNA并使其在体内稳定维持研究目的：有应用价值和理论研究价值2作为受体细胞的原则便于重组DNA分子导入便于重组DNA分子稳定存在于细胞中便于重组子的筛选遗传稳定性高，易于扩大培养（甚至发酵）安全性高，无致病性有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达密码子无明显偏爱性具

2、有较好的翻译后加工机制，便于真核基因的表达理论与实践上具有较高的应用价值3一.原核生物细胞作为受体细胞的优点:(1)不具纤维素壁（除支原体外都有细胞壁，肽聚糖）(2)无核膜(3)基因组简单，便于遗 传分析(4)单细胞作为受体细胞的不足:(1)不具真核蛋白折叠系统(2)不具真核蛋白加工系统(3)蛋白酶降解异源蛋白4目前作为受体菌的原核生物有:(1)大肠杆菌 革兰氏阴性菌 a.基因组、遗传背景了解最清楚 b.易培养、繁殖迅速5(2)枯草杆菌 革兰氏阳性菌 a.具胞外酶分泌-调节基因，能将表达产物 分泌到培养基； b.无内毒素； c.易于保存与培养。 6(3)蓝细菌 a.光能自养型，易于培养； b.

3、与植物密码子和启动子的通用性， 易于表达植物基因7二. 真菌细胞 低等真核生物，具有真核生物基因结构、表达调控体系，具有真核的蛋白折叠、加工与分泌系统。8酵母菌 a.结构最简单的真核生物， 遗传背景较为清楚 b.蛋白翻译后修饰加工系统 c.不含毒素 d.易培养 e.可分泌9三.植物细胞具有纤维素等参与组成的坚硬细胞壁原生质体转化(果胶酶和纤维素酶预处理)基因枪或农杆菌直接转化植物细胞的突出优点:细胞具有全能性10四.动物细胞 多采用生殖细胞、受精细胞或胚细胞，近 年用体细胞培养 常用的动物细胞受体: 小鼠L细胞、Hela细胞、猴肾细胞、中国 仓鼠卵巢细胞(CHO)等11动物细胞的优点：可识别并

4、除去内含子，加工成成熟mRNAb. 翻译后加工，产物具有较好的免疫原性c. 易感染，遗传稳定d. 可分泌表达产物缺点：组织培养技术要求较高，周期长，难度大12第2节 重组DNA分子转入受体细胞 转化(transformation) 重组DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳 定维持并表达的过程13一、重组DNA分子转入大肠杆菌 （一）、转化的原理与方法 细菌转化的本质(革兰氏阳性菌天然转化 局部原生质体化假说): a.细菌感受态形成 b.转化因子的吸收 c.整合复合前体形成 d.单链DNA转化因子的整合 e.转化子的形成14供体菌受体菌感受态单链整合、重组转化子非转化子15对于来自于人工重组

5、DNA, 而非供体菌的游离DNA，革兰氏阴性菌大肠杆菌中，采用人工方法制备感受态1.Ca2+诱导大肠杆菌转化法制备感受态细胞 1970年，Mandel和Higa用Ca2+Cl2处理大肠杆菌，促进 了大肠杆菌对噬菌体DNA的吸收 1972年，Cohen实现了质粒DNA对大肠杆菌的转化 16a.培养生命旺盛的菌体(对数生长期) A600约等于0.4b.沉淀细菌 5000g离心5minc.化合物处理(CaCl2处理) 冰浴菌液(4C)加入等体积CaCl2溶液, 15min17冰浴菌液(4C)4000g离心5min，弃去上清液冰浴菌液(4C)中加入等体积CaCl2溶液, 放置15min沉淀用1/15原

6、体积CaCl2溶液重悬4C下保存，备用(2天内)18DNA分子转化感受态细胞 感受态细胞加入DNA分子 42C水浴上放置45秒(热激) 会有DNA分子进入大肠杆菌细胞里19CaCl2引起大肠杆菌细胞处于感受态可能的原因: Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使内 外膜间核酸酶解离，诱导形成感受态 Ca2+能与DNA分子结合，使DNA与Ca2+ 复合物接近细胞膜，当42C热激处理 时，膜出现间隙，DNA分子进入Flash2Flash1202. 电穿孔转化法 1988年，Dower等人转化大肠杆菌基本原理:高压电脉冲导至电穿孔(electro poration)制备感受态方法:冰浴 重悬213.

7、三亲本杂交转化大肠杆菌法 三亲杂交(tri-parental mating)结合转移法 基于非结合型质粒的迁移作用建立的方法 适于难以采用Ca2+诱导法和电穿孔法的受体菌 三亲杂交过程： 结合型的辅助质粒 含重组DNA质粒的供体细胞受体细胞迁移作用224. 转化效率计算及影响因素 转化效率两种表示方式: 转化率 = 转化子 / DNA分子个数 或 转化率 = 转化子 / DNA质量 转化率 = 转化子 / 受体菌总数23 转化效率的影响因素 质粒大小、结构(超螺旋与否)、与宿主亲和 性、质粒浓度(与转化效率正比例关系) 不同受体细胞具不同转化效率 转化方法不同具不同转化效率 电穿孔法 Ca2+

8、诱导法三亲杂交法24（二）、重组噬菌体DNA分子转导大肠杆菌转染(transfection) 与质粒DNA转化方式相似，重组噬菌体DNA分子 直接导入到受体细胞 重组型转化率103-104 pfu (plaque forming uint)转导(transduction) 通过噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径将外源DNA分子导入受体细胞 重组型转化率106-107 pfu2526（三）、受体细胞选择受体细胞 利于外源DNA的转化或转导 具有较好的安全性 如：野生型大肠杆菌作为受体菌的不足之处 自身限制-修饰作用， 对外源DNA具一定降解作用 ， 存在潜在治病性。27诱变等方法进行遗传性状改

9、良，获得突变型菌株:限制-修饰系统 限制系统缺陷型菌株(hsdR -)重组系统 重组蛋白缺陷型(recA- recB- recC-)易于转化或转导有明显的选择性差异 遗传表型差异大, 易于重组子筛选感染寄生缺陷型28二、重组DNA分子转入真核细胞1.重组DNA分子导入植物细胞按基因导入受体植物细胞的方法不同，植物遗传转化技术大体可分为两类29按基因导入受体植物细胞的方法不同，植物遗传转化技术大体可分为两类1、以载体为媒介的基因转移：就是将目的基因连于某一载体DNA上，然后通过寄主感染受体植物等途径将个源基因转入植物细胞的技术 ，如农杆菌介导的转化。2、基因或DNA的直接转移：DNA的直接转移是

10、指利用植物细胞生物学特性，通过物理、化学和生物学方法将外源基因转入植物细胞的技术，如电激和电注射法、基因枪法、微注射法等。30 1)、农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 农杆菌(Agrobacterium) 土壤习居菌 感染绝大多数双子叶植物与蕨类植物 对绝大多数单子叶植物无侵染能力31外植体 用于植物遗传转化的受体，为植物组织或器官 如：叶片、叶柄、子叶、茎、下胚轴等外植体接种(农杆菌侵染) 外植体浸泡自农杆菌菌液中 注意: 菌液稀时间短基本步骤：32共培养感染后的带菌外植体, 在诱导愈伤组织或不定芽培养基上培养脱菌培养 转移到含有抗生素的培养基上培养,去除农杆菌 常用抗生素: 羧苄青霉素(Ca

11、rb)、头孢霉素(Cef)等筛选培养 外源基因抗生素分化培养 分化培养基3334几种外植体的转化方法:叶盘转化法整株植物转化法原生质体转化悬浮细胞培养 水稻等,种胚制作悬浮细胞352)、DNA的直接转移 多聚物介导法 聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸等 电穿孔转化法 激光微束穿孔法 显微注射 超生波介导转化法 基因枪 脂质体介导法 花粉管导入法362.重组DNA分子导入哺乳动物细胞 病毒颗粒转导法 磷酸钙转染法 DEAE-葡萄糖转染法 聚阳离子-DMSO转染法 显微注射技术 电穿孔法 脂质体介导法37第3节 重组子的筛选重组子 导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞为 转化子，含有重组DNA分

12、子的转化子为重组子筛选(screening)选择(selection)38重组子的筛选方法 遗传表型直接筛选法 依赖重组子结构特征分析的筛选法 核酸分子杂交检测法39一. 遗传表型直接筛选法1.根据载体选择标记初步筛选转化子 (1)抗药性筛选 氨苄青霉素(Ap 或Amp) 氯霉素(Cm或Cmp) 卡那霉素(Kn 或Kan) 四环素(Tc或Tet) 链霉素(Sm 或Str)40 (2)插入失活筛选 Ap rTc r影印BamHISalI41 (3)插入表达筛选 与插入失活相反 Tc rCI蛋白结合区CI蛋白编码区HindIII Bgl I42 (4)显色互补筛选法 -互补 -半乳糖苷酶基因(La

13、cZ)载体(含LacZ ) LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编 码信息，编码-互补肽宿主菌 编码的缺陷型-半乳糖苷酶 肽段43乳糖类似物诱导 IPTG(异丙基-D硫代半乳糖苷) 作用底物 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷) 44MCSLacZLacZ含IPTGX-gal培养基45 (5)利用报告基因筛选植物转化细胞 选择标记基因(selective gene) 报告基因(reporter gene) 利用选择压力，将转基因受体细胞筛选出来； 表达报告基因或与某基因做成嵌合基因，表达 融合蛋白，从报告基因的表达情况了解目的基因 的表达情况及推测基因调控序列。 46新霉素磷

14、酸转移酶(NPT II)潮霉素磷酸转移酶(HPT)氯霉素乙酰转移酶(CAT)抗除草剂bar基因-葡萄糖酸苷酶(GUS)荧光素酶 (LUC)冠瘿碱和成酶 47(6)利用遗传标记筛选哺乳动物转基因细胞 氯霉素乙酰转移酶基因(Cat) 新霉素磷酸转移酶基因(NptII) 胸苷激酶基因(tk) 二氢叶酸还原酶基因(dhfr) 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(xgprt)482.营养缺陷型筛选 转基因克隆本身编码某营养物质合成酶或相 关蛋白，能够在缺少这种营养物质的缺陷型 培养基上生长。 这种培养基对于非转基因克隆是致死的。 493.形成噬菌斑 噬菌体有效包装在有效的大小范围内51-36.4kbp 取代型 形成噬菌斑即为重组子，空载不能有效包装 插入型 空载可形成噬菌斑，可用蓝白斑筛选50二. 依赖重组子结构特征分析的筛选法 1.快速裂解菌落鉴定分子大小HindIIIHindIIIHindIIIABAB51 2.限制性核酸内切酶分析法OriHindIIIEcoRI50bp650bp600bp52 3.利用PCR方法筛选重组子