大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法

1、大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法关于感受态细胞（Competentcells）常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞（competentcell）。转化，是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统

2、缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。a-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码a-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型B-半乳糖苷酶实现基因内互补（a-互补）。当这种载体转入可编码?半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为a-互补现象。由互补产生的a半乳糖苷酶（LacZ）能够作用于生色底物5溴一4氯一3吲哚3D半乳糖苷（X-gal）而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的

3、该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ（a）基因的失活，破坏a-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法方法一：细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。操作过程简述如下。从37C培养1620h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52

4、），或1ml新鲜的1620h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37C剧烈振摇培养约23h（旋转摇床200300r/min）,每隔2030min测量OD600值0.4O在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置1020mino于4C用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。4倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上。于4C用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心

5、10min,以回收细胞。7倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1MCaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻，-70C贮存备用。用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200ul转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物（体积W10ul,DNAW50ng）,轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min将离心管放到预加温到40C的循环水浴中的试管架上，放置90s2min,不要摇动试管。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却12min每离心管加800ulS0C培养基，用水浴将培养基加温到37C,然后将管转移

6、到37C摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。将适当体积（每个90mm平板可达200卩1）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/lMgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。将平板置于室温至液体被吸收。倒置平皿，于37C培养，1216h后可出现菌落。方法二：CASsuperOne-StepCompetentCellPrepsKit采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要求。与CaC12法相比具有多种优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaC12法，一般可达106-108cfu/

7、ug，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70C,无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。准备工作：从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌，在LB平板上划线，37度过夜至长出单菌落。挑形态饱满的单菌落2个，分别接种5mlLB培养基中，37C，250rpm，过夜培养。次日从5mlLB培养物吸取200ul转入50mlLB培养基中（250ml锥形瓶），37C，250rpm培养2小时，此时0D600约0.40.5o感受态细胞的制备：吸取1ml菌液到1.5ml离心管里，5000rpm离心5分钟，弃去上清。加入100ul预冷的SolutionA，悬浮菌体，冰浴30分钟。此时感受态细胞已经制成

8、可立即使用或-70C保存。细胞转化：在感受态细胞中加入100pg-10ngDNA，混匀，冰浴30分钟，然后42C1分钟热击，再次冰浴2分钟。加入0.9mlLB培养基，20ulSolutionB，37C，振荡培养1小时。取适当菌液（100-200ul）涂布相应抗性的平板。过夜培养约16个小时，数菌落数，计算转化率。补充说明：所用器具一定要清洁；操作步骤2中培养基的装量也是很重要的，建议装量不要高于此值：500ml锥形瓶装100ml培养基，250ml锥形瓶装50ml培养基；在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCl2，效果会更好一些；为保证细胞处于对数生长期，培养后的菌体的OD值不要

9、高于0.6；5制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作；6.细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击，冰浴后直接加入新鲜LB,简化操作步骤，但转化效率低于热击方法，适用于对转化率要求不高的实验。方法三：1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2mlLB培养基的试管中，37C振荡培养过夜2、取0.1ml过夜培养物转种于含10mlLB培养基的三角瓶中，37C振荡培养3h至OD600=0.33、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴10min。4、在4C下以4000rpm离心5min，去上清液5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1MCaCl2溶液中，置冰上30min6、然后再在4C下以4000rpm离

10、心10min,去上清液7、将菌体悬浮于0.1mlCaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr备用。方法四：将1ml过夜培养的细菌(如DH52、TG1、TM101)接种于100ml2XYT培养于500ml烧瓶。于37C刷烈振荡，通常三200rpm培养的细菌密度约0D550=0.20.5(5X107cells/ml),需24h。将培养物放于冰上致冷10min，于4C离心细菌培养物，10000rpm离心10min。弃除上清，将细菌悬浮于原始培养体积的一半(约50ml)的50mMCaCl2和10mmTrisHCl(pH8.0)无菌冷冻液体中。将细菌悬浮放在冰上约5min，然后将悬浮物于4C10000/rpm

11、离心10min。弃上清，悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCl和10mMTrisHCl(pH8.0)无菌冷冻中。此时的细胞是感受态细胞，即可用于转化。200ul分装于无菌的1.5ml微量离心管中，贮存于-80C冰箱中。方法五：TSB法(也是本人热衷的方法)药品制备1MMg2+(1MMgSO4和1MMgCl2等体积混合)，用0.22um滤膜超滤除菌。TSB液(30mL/80mL菌液)(现配现用)：PEG33503g1210C,15min灭菌后，加入1MMg2+600uL,以及DMSO3mLTryptone0.3g0.3gYeastextract0.15gNaCl步骤：活化菌株挑单菌落

12、培养于5mL的液笨培养基中取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养370C培养34小时，OD600在0.40.6离心，去上清加入20mLTSB,重悬离心，去上清加入lOmLTSB,再加入1520%的甘油，分装保存注，整个操作过程均应在冰上进行。所用药品均需灭菌。转化程序取出200卩l感受态细胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入DNA或连接反应混合物，DNA量通常W50mg。用手指弹打试管10次，使之混匀，然后放在冰上4045min。将管放于42C水浴中2min。然后每管直接加入1.0ml2XYT培养基，倒置混匀，并于37C培养812h,干浴或水浴，不需振摇。此期间使细菌生长并开始表达抗菌素。每20