临床免疫学检验：第13章 免疫细胞分离与功能检测及其应用

1、1免疫细胞分离与功能检测及其应用2第一节 免疫细胞的分离第二节 淋巴细胞表面标志的检测第三节 抗原提呈细胞表面标志的检测第四节 淋巴细胞功能检查第五节 其他免疫细胞功能检测技术第六节 临床应用主要内容概 述1.免疫细胞与细胞免疫概 述1.免疫细胞与细胞免疫第一节 免疫细胞的分离1.外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）组成淋巴细胞 90%95%单核细胞 5% 10%比重：1.0751.090红细胞比重：1.093粒细胞比重：1.092第一节 免疫细胞的分离1.外周血单个核细胞的分离Ficoll分离液密度梯度离心法

2、Ficoll分离液聚蔗糖-泛影葡胺比重：人 1.077；小鼠 1.085密度梯度离心2000rpm20min第一节 免疫细胞的分离2.淋巴细胞的分离PBMC去除单核细胞贴壁粘附法塑料或玻璃培养瓶孵育1小时缺点：B细胞有所损失吸附柱过滤法_ 玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G10层析柱_ 单核巨噬细胞树突状细胞B细胞T细胞=红细胞第一节 免疫细胞的分离3.T、B细胞和T细胞亚群的分离T、B细胞的分离尼龙毛分离法本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分开。操作原则是取松散而经过处理的尼龙毛（聚酰胺纤维），均匀充填在内径56nm的聚乙烯塑料管（饮料管即可）内，经

3、Hanks液浸透保温，将单个核细胞悬液加入柱内，放37温箱静置12h。用预温的含1020小牛血清培养液灌洗，洗脱液内含有非粘附的T细胞，重复灌洗几次以除去管内残留的T细胞。再用冷或温培养液边冲边洗边挤压塑料管，此时洗脱液内富含B细胞。如此得到的T细胞纯度在90以上，B细胞纯度可达80。第一节 免疫细胞的分离3.T、B细胞和T细胞亚群的分离T细胞亚群的分离磁性微球分离法磁性微球免疫磁珠第一节 免疫细胞的分离3.T、B细胞和T细胞亚群的分离T细胞亚群的分离磁性微球分离法第一节 免疫细胞的分离3.T、B细胞和T细胞亚群的分离T细胞亚群的分离磁性微球分离法第二节 淋巴细胞表面标志的检测表面标志CD分子

4、T细胞？B细胞？第二节 淋巴细胞表面标志的检测表面标志CD分子CD（cluster of differentiation, 分化群）应用单克隆抗体鉴定为主的方法，将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原称为簇分化抗原。表面标志亚群：一个或多个CD分子定义第二节 淋巴细胞表面标志的检测流式细胞术（flow cytometry，FCM）流式细胞术以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。流式细胞仪免疫荧光技术第二节 淋巴细胞表面标志的检测流式细胞术（flow cytometry，FCM）流式细胞仪分析的工作原理第二节 淋巴细胞表面标志的检测

5、一、T细胞表面标志及亚群T细胞CD3+第二节 淋巴细胞表面标志的检测一、T细胞表面标志及亚群T细胞辅助性T细胞（Th细胞）：CD3+CD4+CD8-细胞毒性T细胞（Tc细胞）： CD3+CD4-CD8+调节性T细胞（Treg细胞）： CD4+CD25+Foxp3+第二节 淋巴细胞表面标志的检测一、T细胞表面标志及亚群T细胞辅助性T细胞（Th细胞）：CD3+CD4+CD8-细胞毒性T细胞（Tc细胞）： CD3+CD4-CD8+调节性T细胞（Treg细胞）： CD4+CD25+Foxp3+第二节 淋巴细胞表面标志的检测一、T细胞表面标志及亚群T细胞辅助性T细胞（Th细胞）：CD3+CD4+CD8-

6、细胞毒性T细胞（Tc细胞）： CD3+CD4-CD8+调节性T细胞（Treg细胞）： CD4+CD25+Foxp3+第二节 淋巴细胞表面标志的检测一、T细胞表面标志及亚群T细胞辅助性T细胞（Th细胞）：CD3+CD4+CD8-Th1：IFN-g+-Th2：IL-4+第二节 淋巴细胞表面标志的检测二、B细胞表面标志CD19CD5+:B1细胞CD5-：B2细胞CD5CD19B-1 CellB-2 Cell第二节 淋巴细胞表面标志的检测三、NK细胞表面标志CD3-CD16+CD56+CD5+:B1细胞CD5-：B2细胞第三节 抗原提呈细胞表面标志的检测一、单核-吞噬细胞系统CD14+第三节 抗原提呈

7、细胞表面标志的检测二、树突状细胞CD1a+ 、 CD11c+、CD83+第四节 淋巴细胞功能检测一、T细胞功能检测T细胞功能活化增殖-T细胞增殖试验分化效应Th-CD3+CD4+CD8-Tc-CD3+CD4-CD8+Treg-CD4+CD25+Foxp3+Th（分泌细胞因子）-CK测定Tc（细胞毒作用）-细胞毒试验体内试验第四节 淋巴细胞功能检测一、T细胞功能检测T细胞增殖试验非特异性增殖- 丝裂原：PHA、刀豆蛋白A（ConA）、美洲商路蛋白（PWM）特异性增殖抗原：破伤风类毒素、PPD、白色念珠菌方法- 形态学方法第四节 淋巴细胞功能检测一、T细胞功能检测T细胞增殖试验非特异性增殖- 丝裂

8、原：PHA、刀豆蛋白A（ConA）、美洲商路蛋白（PWM）特异性增殖抗原：破伤风类毒素、PPD、白色念珠菌方法- 形态学方法第四节 淋巴细胞功能检测一、T细胞功能检测淋巴细胞淋巴母细胞第四节 淋巴细胞功能检测一、T细胞功能检测T细胞增殖试验非特异性增殖- 丝裂原：PHA、刀豆蛋白A（ConA）、美洲商路蛋白（PWM）特异性增殖抗原：破伤风类毒素、PPD、白色念珠菌方法形态学方法MTT比色法（最常用）第四节 淋巴细胞功能检测一、T细胞功能检测T细胞增殖试验非特异性增殖- 丝裂原：PHA、刀豆蛋白A（ConA）、美洲商路蛋白（PWM）特异性增殖抗原：破伤风类毒素、PPD、白色念珠菌方法形态学方法M

9、TT比色法（最常用）3H-TdR掺入法（最标准）第四节 淋巴细胞功能检测一、T细胞功能检测液体闪烁仪3H-TdR掺入法原理第四节 淋巴细胞功能检测一、T细胞功能检测T细胞分泌功能测试细胞因子的测定（见后面章节）第四节 淋巴细胞功能检测一、T细胞功能检测T细胞介导的细胞毒试验CTL细胞杀伤靶细胞第四节 淋巴细胞功能检测一、T细胞功能检测T细胞介导的细胞毒试验CTL细胞杀伤靶细胞方法形态学方法MTT法51Cr释放法第四节 淋巴细胞功能检测一、T细胞功能检测51Cr释放法g计数仪第四节 淋巴细胞功能检测一、T细胞功能检测体内试验皮肤试验-迟发型超敏反应结核菌素试验各种皮肤试验第四节 淋巴细胞功能检测

10、二、B细胞功能检测溶血空斑试验SRBC+致敏脾细胞产生的抗体+补体=溶解空斑结核菌素试验第四节 淋巴细胞功能检测二、B细胞功能检测酶联免疫斑点试验（ELISPOT）包被抗原+抗体生成细胞+酶标二抗+底物=颜色深浅第四节 淋巴细胞功能检测二、B细胞功能检测酶联免疫斑点试验包被抗原+抗体生成细胞+酶标二抗+底物=颜色深浅第四节 淋巴细胞功能检测三、NK细胞功能检测人NK-K562细胞；小鼠NK-YAC-1细胞方法形态学法酶释放法（乳酸脱氢酶，LDH）51Cr释放法第五节 其它免疫细胞功能检测吞噬细胞功能检测趋化功能检测方法- 滤膜渗透法第五节 其它免疫细胞功能检测吞噬细胞功能检测趋化功能检测方法- 滤膜渗透法第五节 其它免疫细胞功能检测吞噬细胞功能检测趋化功能检测方法- 琼脂糖平板法第六节 临床应用全面反映细胞免疫状态计数技术成熟，常用CD4/CD8比值升高：自身免疫性疾病降低：病毒感染（AIDS）、恶性肿瘤、再障注意：1.与患者免疫功能不完全相符 2.只是外周血细胞计数 3.数量的差别不能准确反映功能的差别 4.实验误差功能总 结全面反映细胞免