临床免疫学检验：第12章 免疫组织化学技术

1、第十二章 免疫组织化学技术(Chapter 12 Immunohistochemistry Technique) 免疫组织化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。第十二章 免疫组织化学技术(Chapter 12 Immunohistochemistry Technique)免疫反应的特异性；组织化学的可见性；分子生物学的敏感性；显微镜的显像和放大作用。免疫组织化学技术的基本过程第一节 免疫组织化学技术的技术要点(Section 1 key technological points of The T

2、echnique)抗原的提取及纯化；制备抗体；制备标记抗体；标本的处理与制备；抗原抗体反应及标记物呈色反应；观察结果。一、 标本的处理第一节 免疫组织化学技术的技术要点(Section 1 key technological points of The Technique)活体组织各种体液及穿刺液培养细胞（一）标本的处理一、 标本的处理第一节 免疫组织化学技术的技术要点(Section 1 key technological points of The Technique)固定胞内蛋白，终止细胞内酶的反应，保持细胞形态和结构，保留细胞抗原性。各种体液及穿刺液培养细胞（二）标本的固定与保存二、抗

3、原的保存与修复第一节 免疫组织化学技术的技术要点(Section 1 key technological points of The Technique)酶消化法盐酸水解法微波法高压锅法煮沸法三、抗体的处理与保存第一节 免疫组织化学技术的技术要点(Section 1 key technological points of The Technique)抗体的选择抗体的稀释抗体的保存四、免疫组织化学的结果判断第一节 免疫组织化学技术的技术要点(Section 1 key technological points of The Technique)对照的设立：阳性对照、阴性对照、空白对照阳性结果：颜

4、色位置、深浅、分布阴性结果及抗原不表达：不可否定意义特异性和非特异性显色的鉴别免疫组织化学结果与苏木素-伊红（HE）染色切片结果第二节 酶免疫组织化学技术(Section 2 Enzyme immunohistochemistry technique) 酶免疫组化技术是在一定条件下，应用酶标记抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（或抗体）发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜观察标本中抗原（或抗体）的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。酶标记抗体免疫组织化学技术非标记抗体酶免疫组织化学技术一、组织处理第二节 酶免疫组织化学技术(Section 2 Enzyme immuno

5、histochemistry technique)常用标本：固定的组织切片、组织印片、细胞涂片等；标本可长期保存；可用显微镜直接观察结果。二、酶标记抗体免疫组织化学染色第二节 酶免疫组织化学技术(Section 2 Enzyme immunohistochemistry technique)直接法间接法 借助交联剂共价键将酶直接连接在抗体上，酶标记抗体与靶抗原反应后，通过酶对底物的特异性催化作用，生成不溶性有色产物，沉淀在靶抗原位置，达到对抗原定位及定性、定量检测的目的。二、非标记抗体酶免疫组织化学染色第二节 酶免疫组织化学技术(Section 2 Enzyme immunohistochem

6、istry technique)酶桥法PAP法双桥PAP法 先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，通过免疫学反应将抗酶抗体与组织抗原联系在一起。该方法避免了酶标记时对抗体的损伤，也提高了敏感性。二、非标记抗体酶免疫组织化学染色第二节 酶免疫组织化学技术(Section 2 Enzyme immunohistochemistry technique)酶桥法（goat anti-rabbit）二、非标记抗体酶免疫组织化学染色第二节 酶免疫组织化学技术(Section 2 Enzyme immunohistochemistry technique)过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）法二、非标

7、记抗体酶免疫组织化学染色第二节 酶免疫组织化学技术(Section 2 Enzyme immunohistochemistry technique)过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）法PAP复合物结构稳定；敏感性高；背景着色淡二、非标记抗体酶免疫组织化学染色第二节 酶免疫组织化学技术(Section 2 Enzyme immunohistochemistry technique)双桥PAP法在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP复合物；明显的放大作用，增强敏感性。第三节 荧光免疫组织化学技术(Section 3 Fluorescent Immunohistochemistry Technique

8、) 采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，可分辨出抗原（或抗体）所在位置及性质，并可利用荧光定量技术计算其含量。组织处理第三节 荧光免疫组织化学技术(Section 3 Fluorescent Immunohistochemistry Technique)涂片和印片组织切片：组织切片、石蜡切片细胞培养标本活细胞染色标本的保存第四节 亲和组织化学技术(Section 4 Affinity histochemistry technique) 利用可与多种标记物结合的两种物质之间的高度亲和力，采用荧光

9、显微镜、酶加底物的显色反应、放射自显影或电子显微镜等，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位、定性或定量分析。 亲和组织化学包括：抗原与抗体、植物血凝素与糖类、生物素与亲合素、葡萄球菌A蛋白与IgG等。第四节 亲和组织化学技术(Section 4 Affinity histochemistry technique)一、生物素-亲合素法（一）标记亲合素-生物素技术（LAB）第四节 亲和组织化学技术(Section 4 Affinity histochemistry technique)一、生物素-亲合素法（二）桥联亲合素-生物素技术（BAB）第四节 亲和组织化学技术(Section 4 Aff

10、inity histochemistry technique)一、生物素-亲合素法（三）生物素-亲合素法-过氧化物酶复合物技术（ABC）第四节 亲和组织化学技术(Section 4 Affinity histochemistry technique)二、葡萄球菌蛋白A法 SPA从金黄色葡萄球菌细胞分离而来，可与多种动物IgG的Fc段结合。用SPA标记物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的免疫检测试验。第四节 亲和组织化学技术(Section 4 Affinity histochemistry technique)三、凝集素法 凝集素（lectin）因能使红细胞聚集而得名。与特定

11、糖基专一结合，其受体是存在于细胞膜上的糖蛋白和糖脂中的寡糖（细胞发育、成熟、分化、代谢改变、恶变转化等过程中发生改变）。故凝集素可以作为探针，采用直接法、间接法进行细胞化学染色，研究细胞上的糖基，特别是细胞膜上的微小化合物结构，从而探索细胞的生物学结合和演变过程。第四节 亲和组织化学技术(Section 4 Affinity histochemistry technique)四、链霉亲合素-生物素法（LSAB） 链霉亲合素（SA）因从链霉素提纯而得名。表面所带正电荷少，且不含任何糖基，有4个生物素结合位点，并具有高度的亲和力，非特异性结合低于生物素。同时，SA分子量小，易于穿透组织、细胞，也可

12、增强其敏感性。故得到更广泛的应用。第四节 亲和组织化学技术(Section 4 Affinity histochemistry technique)特点高敏感性操作简便、省时对抗原定性、定位、定量分析准确、清晰第五节 免疫标记电镜技术(Section 5 Immunoelectron Microscope) 免疫电子显微镜（IEM）技术是利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应可产生高电子密度产物的酶（如HRP等）标记抗体，在电子显微镜下对抗原抗体反应中的高电子密度标记的抗原（或抗体）进行亚细胞水平定位的技术。更精确、可定位至细胞膜、细胞器，在探索病因、发病机制、组织发生等方面具有独特的优点。第五节 免疫标记电镜技术(Section 5 Immunoelectron Microscope)免疫胶体金染色法免疫胶体铁细胞化学染色法酶免疫电镜技术常用的免疫标记电镜技术第六节 免疫组织化学技术的应用(Section 6 Application of Immunohistochemistry Technique)在