PCR的定义、历史与运用

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4、ml ./SShopp/477.shhtmll何谓PCCR 简单单的说，PCRR就是利利用DNNA HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-473.html 聚合合酶对特特定基因因做体外外或 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-952.html 试管管内(InVittro)的大大量合成成。基本本上它是是利用DDNA聚聚合酶进进行专一一性的连连锁复制制.目前前常用的的技术,可以将将一段基基因复制制为原来来的一百百亿至一一千亿倍倍。 PCRR的要素素 基基本的PPCR须须具备.要被被复制的的DNAA模板(Teempllatee).界定定复

5、制范范围两端端的引物物(Prrimeers).DNNA聚合合酶(Taqq.PPolyymeaarsee)4.合合成的原原料及水水。PCCR反应应包括三三个主要要步骤，分别是是 1).DDenaaturratiion2).AAnneealiingofpriimerrs,andd3).EExteensiionofpriimerrs。所谓Dennatuurinng乃是是将DNNA加热热变性，将双双股的DDNA加加热后转转为单股股DNAA以做为为复制的的模板.而AAnneealiing则是令令Prrimeers于于一定的的温度下下附着于于模板DDNA两两端。最后在在DNAA聚合酶酶(ee.g.Taaq

6、-ppolyymerrasee)的的作用下下进行引引物的延延长(Exttenssionnoffprrimeers)及另一一股的合合成。PCR的的历史 PPCR的的发展可可以说是是从DNNA合成成酵素的的发现缘缘起。DDNA合合成酵素素最早于于19555年发发现(DNAApoolymmeraaseI),而较较具有实实验价值值及可得得性的 KleenowwfrragmmenttoffEE.CColii则是是于700年代的的初期由由Dr.H.Kllenoow所所发现,但由由于这个个酵素是是一种易易被热所所破坏之之酵素,因此此不符合合一连串串的高温温连锁反反应所需需。现今今所使用用的酵素素(简简称TT

7、aqpollymeerasse),则是是于19976年年从热泉泉Hootsspriing中中的细菌菌(ThhermmusAquuatiicuss)分分离出来来的。它的特特性就在在于能耐耐高温，是一个个很理想想的酵素素，但它它被广泛泛运用则则于800年代之之后。PPCR的的原始雏雏形概念念是类似似基因修修复复制制(DDNAreppairrreepliicattionn)，它它是于119711年由Dr.KjjelllKllepppe提提出。他他发表第第一个单单纯且短短暂性基基因复制制(类类似PCCR前两两个周期期反应)的实实验。而现今今所发展展出来的的PCRR则于119833由DDr.KarryB

8、B.MMulllis发发展出的的，Drr.MMulllis当当年服务务于一家家物科技技研究公公司(Perrkinn- EElmeerCCetuusCCorpporaatioon).目前前这家公公司在PPCR的的相关仪仪器及原原料上占占有很大大的巿场场。Drr.Muulliis并并于19985年年与SSaikki等等人正式式表了第第一篇相相关的论论文。此此后，PPCR的的运用一一日千里里，相关关的论文文发表质质量可以以说是令令众多其其它研究究方法难难望其项项背。在在19989年，SScieencee将PPCR中中的DNNA合成成酵素命命名为当当年的风风云分子子(MMoleeculleooftth

9、eyeaar)，而PCCR本身身则列为为年度的的重要科科学发明明产物。当然，它的原原发明者者更在往往后获得得诺贝尔尔的桂冠冠。 影响PPCR的的因素 PPCR是是非常直直接、简简单又具具有强大大威力的的技术。诚如一一位当年年参与PPCR诞诞生的资资深研究究员HeenryyErrlicch所言言”在分分子生物物学的领领域中，只要拥拥有它，你便可可以无照照营业” (PPCRalllowsspeeopllettoppraccticcemmoleecullarbioologgywwithhouttalisscennce)。也因因此，活活用及慎慎用PCCR是确确保一定定品质的的必要条条件。PPCR本本身

10、虽然然是一个个单纯的的实验技技术，但但是一个个好的PPCR反反应及其其产物则则是受到到很多因因素的影影响。这这些因素素色括反反应中各各种原料料的浓度度(TTaq.Poolymmeraase,prrimeers,dNNTPss,MMgCll2)，也包包括整个个反应中中各步骤骤的温度度与时间间的设定定。当然然DNAA模板(Temmplaate)与引信(Prrimeers)本身身条件也也占有一一定的重重要性。近来的的观念中中，共溶溶剂诸如如Diimetthyllsuulfooxidde(DSMMO)、glyycerrol、 FoorammideeanndTTetrrameethyylammmonni

11、ummchhlorridee(TTMACC)也也对整个个反应产产生若干干重要的的影响。 PPCR的的运用 PPCR除除了是一一个诊断断工具外外，更重重要的是是它有广广泛的运运用。PPCR本本身可直直接用来来鉴定特特定基因因的存在在与否，也可以以用来侦侦测基因因是否有有异常(Geenemuttatiion,deelettionn,aandreaarraangeemennt)。例如如，在医医学上对对遗传疾疾病或肿肿瘤癌症症的诊断断及预后后的评估估；对对细菌、病毒及及霉菌感感染的诊诊断。它它也可成成为一个个生产线线进而大大量复制制特定的的基因进进行基因因密码的的读取(DNNAssequuenccin

12、gg)及及其它的的运用。举凡对对生物标标本及法法医学上上的样本本鉴定，从单一一毛发、一只精精虫或一一滴血液液、唾液液来找出出凶手。也可可以做DDNA指指纹(Finngerrpriintss)比比对帮助助亲子关关系的鉴鉴定。PPCR更更可以用用于器官官移植组组织兼容容性HLLA的分分析。另另外在演演化上的的分析，经由PPCR的的运用也也产生重重大的进进展。近近来，在在生物医医学的研研究上，特别是是细胞间间讯息的的传递分分子，诸诸如介白白质(Intterlleukkinees)及各种种 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-641.html 生长因因子(Groowth

13、hfaactoors)基因因的表现现都可用用 PCCR来进进行质与与量的分分析。 PCRR污染及及解决对对策PCCR检测测微量感感染因子子时，一一定要注注意产物物残留污污染的问问题。 一污染染的预防防 进行行PCRR操作时时，操作作人员应应该严格格遵守一一些操作作规程，最大程程度地降降低可能能出现的的PCRR污染或或杜绝污污染的出出现。 （一）划分操操作区：目前，普通PPCR尚尚不能做做到单人人单管，实现完完全闭管管操作，但无论论是否能能够达到到单人单单管，均均要求实实验操作作在三个个不同的的区域内内进行，PCRR的前处处理和后后处理要要在不同同的隔离离区内进进行： 1.标本处处理区，包括扩扩

14、增摸板板的制备备； 22.PPCR扩扩增区，包括反反应液的的配制和和PCRR扩增； 3.产物物分析区区，凝胶胶电泳分分析，产产物拍照照及重组组克隆的的制备。 各工工作区要要有一定定的隔离离，操作作器材专专用，要要有一定定的方向向性。如如：标本本制备PCRR扩增产物分分析产产物处理理。 切切记：产产物分析析区的产产物及器器材不要要拿到其其他两个个工作区区。（二）分分装试剂剂：PCCR扩增增所需要要的试剂剂均应在在装有紫紫外灯的的 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-347.html 超净工工作台或或负压工工作台配配制和分分装。所所有的加加样器和和 HYPERLIN

15、K .ebioe./yp/product-list-925.html 吸头需固固定放于于其中，不能用用来吸取取扩增后后的DNNA和其其他来源源的DNNA： 1PCRR用水应应为高压压的双蒸蒸水； 2引物和和dNTTP用高高压的双双蒸水在在无PCCR扩增增产物区区配制； 3引物物和dNNTP应应分装储储存，分分装时应应标明时时间，以以备发生生污染时时查找原原因。 (三)实验验操作注注意事项项尽尽管扩增增序列的的残留污污染大部部分是假假阳性反反应的原原因，样样品间的的交叉污污染也是是原因之之一。因因此，不不仅要在在进行扩扩增反应应是谨慎慎认真，在样品品的收集集、抽提提和扩增增的所有有环节都都应该注

16、注意： 1.戴一次次性手套套，若不不小心溅溅上反应应液，立立即更换换手套； 2.使用用一次性性 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-925.html 吸头，严严禁与PPCR 产物分分析室的的吸头混混用，吸吸头不要要长时间间暴露于于空气中中，避免免气溶胶胶的污染染； 33.避避免反应应液飞溅溅，打开开 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-958.html 反应管管时为避避免此种种情况，开盖前前稍离心心收集液液体于管管底。若若不小心心溅到手手套或桌桌面上，应立刻刻更换手手套并用用稀酸擦擦拭桌面面； 44.操操作多份份样品时时，制备备反

17、应混混合液，先将ddNTPP、缓冲冲液、引引物和酶酶混合好好，然后后分装，这样即即可以减减少操作作，避免免污染，又可以以增加反反应的精精确度； 5.最后后加入反反应模板板，加入入后盖紧紧 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-958.html 反应管管； 6.操作作时设立立阴阳性性对照和和空白对对照，即即可验证证PCRR反应的的可靠性性，又可可以协助助判断扩扩增系统统的可信信性； 7.尽可能能用可替替换或可可高压处处理的加加样器，由于加加样器最最容易受受产物气气溶胶或或标本DDNA的的污染，最好使使用可替替换或高高压处理理的加样样器。如如没有这这种特殊殊的加样样器

18、，至至少PCCR操作作过程中中加样器器应该专专用，不不能交叉叉使用，尤其是是PCRR产物分分析所用用加样器器不能拿拿到其它它两个区区； 88.重重复实验验，验证证结果，慎下结结论。 二追踪污污染源 如果不不慎发生生污染情情况，应应从下面面几条出出发，逐逐一分析析，排除除污染。 （一一）设立立阴阳性性对照：有利于于监测反反应体系系各成分分的污染染情况。选择阳阳性对照照时，应应选择扩扩增弱，且重复复性好的的样品，因强阳阳性对照照可产生生大量不不必要的的扩增序序列，反反而可能能成为潜潜在的污污染源。如果以以含靶序序列的重重组质粒粒为对照照，1000个拷拷贝之内内的靶序序列就足足以产生生阳性扩扩增。阴

19、阴性对照照的选择择亦要慎慎重，因因为PCCR敏感感性极高高，可以以从其它它方法（Souurthhernn印迹迹或点杂杂交等）检测阴阴性的标标本中检检测出极极微量的的靶分子子。此外外，每次次扩增均均应包括括PCRR体系中中各试剂剂的时机机对照，即包括括PCRR反应所所需的全全部成分分，而不不加模板板DNAA，这对对监测试试剂中PPCR产产物残留留污染是是非常有有益的。如果扩扩增结果果中试剂剂对照为为阳性结结果，就就是某一一种或数数种试剂剂被污染染了。此此时，要要全部更更换一批批新的试试剂进行行扩增，扩增时时设立不不同的反反应管，每一管管含有一一种被检检测试剂剂，在检检出污染染试剂后后，应马马上处

20、理理。 （二）环环境污染染：在排排除试剂剂污染的的可能性性外，更更换试剂剂后，若若不久又又发现试试剂被污污染了，如果预预防措施施比较严严密，则则考虑可可能为环环境污染染。 环境境污染中中常见的的污染源源主要有有： 11.模模板提取取时真空空抽干装装置； 2.凝胶电电泳加样样器； 3.电泳装装置； 4.紫外分分析仪； 5.切胶胶用刀或或手术刀刀片； 6. HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-47.html 离心机机； 7.冰箱箱门把手手，冷冻冻架，门门把手或或实验台台面等； 此时时可用擦擦拭实验验来查找找可疑污污染源。1）用用无菌水水浸泡过过的灭菌菌棉签擦擦拭可疑

21、疑污染源源；2）0.11ml去去离子水水浸泡；3）取取5mll做PCCR实验验；4）电泳检检测结果果。 88.气气溶胶。如果经经过上述述追踪实实验，仍仍不能查查找到确确切污染染源，则则污染可可能是由由空气中中PCRR 产物物的气溶溶胶造成成的，此此时就应应该更换换实验场场所，若若条件不不允许，则重新新设计新新的引物物（与原原引物无无相关性性）。 三污污染处理理 （一一）环境境污染 1.稀酸处处理法：对可疑疑器具用用1mool/LL盐酸擦擦拭或浸浸泡，使使残余DDNA脱脱嘌呤； 2.紫外外照射（UV）法：紫紫外波长长（nmm）一般般选择2254/3000nm，照射330miin即可可。需要要注意

22、的的是，选选择UVV作为消消除残留留PCRR产物污污染时，要考虑虑PCRR产物的的长度与与产物序序列中碱碱基的分分布，UUV照射射仅对5500bbp以上上长片段段有效，对短片片段效果果不大。UV照照射时，PCRR产物中中嘧啶碱碱基会形形成二聚聚体，这这些二聚聚体可使使延伸终终止，但但并不是是DNAA 链中中所有嘧嘧啶均能能形成二二聚体，且UVV照射还还可使二二聚体断断裂。形形成二聚聚体的程程度取决决于UVV波长，嘧啶二二聚体的的类型及及与二聚聚体位点点相邻 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-674.html 核核苷酸的的序列。在受照照射的长长DNAA链上，形成

23、二二聚体缺缺陷的数数量少于于0.0065/碱基，其他非非二聚体体的光照照损伤（如环丁丁烷型嘧嘧啶复合合体，胸胸腺嘧啶啶乙二醇醇，DNNA链间间与链内内的交联联和 DDNA断断裂等）均可终终止TaaqDDNA聚聚合酶的的延伸。这些位位点的数数量与二二聚体位位点相当当。如果果这些位位点（00.133/碱基基）在DDNA分分子上随随机分布布，一个个 5000bpp片段的的DNAA分子链链上将有有32处处损伤位位点，那那么，1105个个这样的的分子中中每个分分子中会会至少有有一处损损伤。相相反，如如果1000bpp的片段段，每条条链上仅仅有 66处损伤伤，1005个拷拷贝分子子中将有有许多分分子没有有

24、任何损损伤。这这就是UUV照射射有一定定的片段段长度限限制的原原因。（二）反反应液污污染 可可采用下下列方法法之一处处理： 1.DNaaseI法：PCRR混合液液（未加加模板和和Taqq聚合酶酶）加入入0.55UDDNasseII，室温温反应330mmin后后加热灭灭活，然然后加入入模板和和Taqq聚合酶酶进行正正常PCCR扩增增。该方方法的优优点是不不需要知知道污染染DNAA的序列列； 22.内内切酶法法：选择择识别44个碱基基的内切切酶（如如MsppI和和TaqqI等等），可可同时选选择几种种，以克克服用一一种酶只只能识别别特定序序列的缺缺陷，室室温作用用1h后加热热灭活进进行PCCR；

25、3.紫外照照射法：未加模模板和TTaq聚聚合酶的的PCRR混合液液进行紫紫外照射射，注意意事项与与方法同同上述UUV照射射法； 4.g射线线辐射法法：1.5kGGy的辐辐射可完完全破坏坏0.11ng基基因组DDNA，2.00kGGy可破破坏1004拷贝贝的质粒粒分子，4.00kGGy仍不不影响PPCR，但高于于此限度度会使PPCR扩扩增效率率下降。引物可可受照射射而不影影响PCCR，gg射线是是通过水水的离子子化产生生自由基基来破坏坏DNAA的。（三）尿尿嘧啶糖糖苷酶（UNGG）法 由于UUV照射射的去污污染作用用对5000bpp以下的的片段效效果不好好，而临临床用于于检测的的PCRR扩增片片

26、段通常常为 3300bbp左右右，因此此UNGG的预防防作用日日益受到到重视和和肯定。 1.原理理：在PPCR产产物或引引物中用用dU代替ddT。这这种dUU化的PPCR产产物与 UNGG一起孵孵育，因因UDGG可裂解解尿嘧啶啶碱基和和糖磷酸酸骨架间间的N-糖基键键，可除除去dUU而阻止止TaqqDNAA聚合酶酶的延伸伸，从而而失去被被再扩增增的能力力。UNNG对不不含dUU的模板板无任何何影响。UNGG可从单单或双链链DNAA中消除除尿嘧啶啶，而对对RNAA中的尿尿嘧啶和和单一尿尿嘧啶分分子则无无任何作作用。 2.dUTTP法：用 ddUTPP代替ddTTPP，使产产物中掺掺入大量量dU。在

27、再次次进行PPCR扩扩增前，用UNNG处理理PCRR混合液液即可消消除PCCR产物物的残留留污染。由于UUNG在在PCRR循环中中的变性性一步便便可被灭灭活，因因此不会会影响含含dU的的新的PPCR产产物。 3.dU引引物法：合成引引物时以以dU代dTT，这样样PCRR产物中中仅5端带 dU。UNGG处理后后，引物物失去了了结合位位点而不不能扩增增。对长长片段（1-22kb以以上）的的扩增用用dUTTP法效效率较用用dTTTP低，而用ddU法就就可克服服这一缺缺点。 dU引引物最好好将dUU设计在在3端或近近端。该该法仅能能用于引引物以外外试剂的的处理。 4.优点点：可以以去除任任何来源源的污

28、染染；UNNG处理理可以和和PCRR扩增在在同一个个反应管管内进行行；由于于扩增产产物中有有大量ddU存在在，可彻彻底消除除污染源源。 55.需需注意的的是掺入入dUTTP的DDNA不不应对产产物的任任何操作作有影响响，在进进行PCCR产物物克隆时时，应该该转化UUNG-（UNNG缺陷陷）大肠肠杆菌受受体菌，否则转转化产物物会被受受体菌UUNG消消化掉。 （四四）固固相捕获获法 用用于去除除标本中中污染的的核酸和和杂质，原理如如下：11）用一一生物素素标记的的单链RRNA探探针与待待扩核酸酸杂交，杂交区区域是非非扩增区区；2）用包被被链霉亲亲和素的的固相载载体来捕捕获带有有生物素素探针的的杂交

29、核核酸，通通过漂洗洗可去除除污染的的扩增产产物和杂杂质；33）洗脱脱靶分子子后用特特异引物物扩增非非RNAA探针杂杂交区域域。第22）步的的漂洗后后可用PPCR检检测以确确定标本本是否被被扩增产产物或重重组质粒粒污染。 （五五）RSS-PCCR法（RNAA-sppeciificcPCCR） 也称为为链特异异性PCCR，主主要指用用于 RRNA模模板的特特异性PPCR法法，该法法可明显显降低假假阳性而而不影响响PCRR的敏感感性。其其关键在在于设计计引物，逆转录录引物的的3端（AA区）有有200个 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-674.html 核苷苷酸左右

30、右为模板板的特异异性互不不序列，5端20个核核苷酸（C区）为附加加修饰碱碱基。与与mRNNA逆转转录后，经超速速离心使使cDDNA与与多余引引物分开开，再用用和第二二引物（C）以以第一链链cDNNA为模模板合成成第二链链cDNNA，以以后的PPCR循循环中用用逆转录录引物的的B区和和引物CC进行扩扩增加尾尾cDNNA，而而污染的的DNAA或质粒粒DNAA才不会会被扩增增。 （六）抗抗污染引引物法 该对引引物扩增增时通过过病毒DDNA克克隆如入入质粒的的位点。这一区区域只存存在完整整的原病病毒中，在重组组质粒中中，这一一区域分分成两个个区域与与克隆位位点被。如果重重组质粒粒污染了了标本，也不能能

31、扩增出出任何条条带，即即使出现现了扩增增带，其其大小也也与预期期的不同同。只有有原病毒毒DNAA才能被被引物扩扩增，因因此只要要出现预预期大小小的扩增增带就可可以证明明标本是是阳性的的，该法法试用于于环状靶靶分子系系列。 四其其它PCCR检测测方法： （一一）两两步法：是指在在用套式式 PCCR方法法扩增某某些含量量低微的的标本时时，两对对引物在在同一个个管中以以简化步步骤，减减少污染染。通常常第一步步进行220-225个循循环，扩扩增外引引物片段段；第二二步再进进行100个循环环，扩增增内引物物片段。两步法法对内外外引物的的Tm值值有特殊殊要求，即内外外引物的的退火温温度高（如688），在在

32、此温度度下内引引物不与与模板退退火，然然后降低低退火温温度（至至 555）再扩扩增内引引物片段段，这样样，在操操作过程程中，仅仅打开PPCR反反应管一一次，大大大减少少了污染染的可能能性。（二）荧光法法：亦称称荧光PPCR技技术（ffluooressenccePCRR,FF-PCCR），是19995年年由美国国PE公公司首先先研制成成功的，它融汇汇了 PPCR的的灵敏性性、DNNA杂交交的特异异性和光光谱技术术精确定定量的优优点，电电脑同步步跟踪，数据自自动化处处理，直直接探测测PCRR过程中中的变化化以获得得定量的的结果，不需要要做 PPCR后后处理或或检测，完全闭闭管操作作。探针针标记除除用TEET和FFAM外外，还可可用HEEX、JJ