汉黄芩素对移植人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠组织端粒酶蛋白hTERT影响与

1、汉黄芩素对移植人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠组织端粒酶蛋白hTERT影响与【摘要】目的评价汉黄芩素对移植人卵巢癌SKV3细胞裸鼠组织端粒酶蛋白hTERT影响与凋亡相关性。方法移植人卵巢癌SKV3细胞的裸鼠随机分为5组：汉黄芩素高剂量组，低剂量组，空白对照组，常规化疗组顺铂和结合用药顺铂+汉黄芩素组。采用抗生素-生物素过氧化酶复合物S-P免疫组化法检测裸鼠组织中hTERT，Bl-2，Bax蛋白及凋亡指数的表达。结果裸鼠组织经汉黄芩素作用后，随着汉黄芩素剂量的增大，对瘤体端粒酶hTERT蛋白表达有抑制作用，呈剂量依赖性。Bl-2蛋白表达逐渐下调，与凋亡指数变化的表达呈相反变化趋势，而Bax蛋白表达逐渐

2、上调，与凋亡指数变化的表达呈同向变化趋势。结论汉黄芩素在体内具有抗肿瘤和抑制端粒酶活性的作用，抑制强度与剂量成正比，下调端粒酶活性，同时也伴随细胞的凋亡，可能是药物对端粒活性的抑制和对端粒构造的破坏，启动了凋亡基因。【关键词】汉黄芩素卵巢肿瘤端粒酶凋亡Abstrat：bjetiveRegulatingteleraseativatinisanidealayttreataner.urrentstudiesshthatgninhastheattributesfantixidatinandinhibitinnthegrthfturells.Thisstudyaiedatevaluatingtherel

3、atinshipbeteenteleraseativatinandapptsisaftergninadinistratininnudeiehihiplantedhuanvariananerellsSKV3.ethdsNudeieithiplantedhuanvariananerellsSKV3ererandlydividedintfivegrups,inludinghighdsegrup,ldsegrup,nralntrlgrup,isplatintherapygrup,andbinedtherapygrup(isplatinandgnin).TheexpressinfhTERT,Bl-2,B

4、axandtheapptsisindexeredetetedbyiunhistheistry.ResultsTheresultsshedthatgninuldsignifiantlysuppressthegrthfturparedithntrlledgrup.Thednexpressinfteleraseativatinandtheeffetivenessasrelatedtthedsefgnin.iththeinreasefsuppressingntur,theexpressinfBl-2dereaseregularly,anditshedtheppsitetendenyftheapptsi

5、sindex.hiletheexpressinfBaxinreasedregularly,anditshedthesaetendenyiththehangefapptsisexpressin.nlusingnisansuppressthegrthfturandregulateteleraseativatin.Theeffetivenessisrelatedtthedsefgnin,theeffetfgninuldbebetterifitisbinedithisplatininthetreatentftur.Itdnregulatestheativatinfteleraseapanieditha

6、pptsisfells,thepssiblereasnisthatitdaagesthestruturefteleraseandsithnapptsisgene.Keyrds：gnin;Turfthevary;Telerase；Apptsis端粒酶是维持端粒长度、确保肿瘤细胞不退出细胞周期而得以永生化的关键之一。85%的肿瘤细胞表达端粒酶活性，端粒酶的激活与肿瘤增殖亲密相关，因此端粒酶成为治疗恶性肿瘤的一个理想的靶点。近年来寻找和研究端粒酶抑制剂是国内外研究的一个热点。本课题组前期研究汉黄芩素说明在体外它具有诱导卵巢癌细胞凋亡作用，能抑制端粒酶活性的表达1。本研究通过动物实验，观察汉黄芩素对肿

7、瘤生长的抑制作用，并研究其对移植人卵巢癌SKV3细胞裸鼠组织端粒酶蛋白hTERT影响与凋亡的相关性。1材料1.1细胞人卵巢癌SKV3细胞由广西肿瘤防治研究所提供。培养于含10%的小牛血清，100u/l青霉素和100g/l链霉素的RPI-1640培养液中，37，5%2培养箱中孵育培养、传代。1.2药物汉黄芩素是从黄芩根中别离出的一种单体，分子量为284kDa，黄色晶体，其化学性质、理化性质、光谱数据参见文献2。注射用顺铂冻干型，齐鲁制药消费。2方法2.1动物分组及给药将对数生长期的人卵巢癌细胞SKV3经胰酶消化后，制备成107/l的细胞悬液，每只裸鼠腋部皮下接种0.2l，约2周后接种原位出现肿瘤

8、，成功率为27/30。选取其中25只裸鼠随机分为5组即：汉黄芩素高剂量A组600gkg-1d-1；低剂量B组300gkg-1d-1；常规治疗组腹腔注射顺铂3gkg-1d-1；结合用药D组同时用腹腔注射顺铂3gkg-1d-1和灌胃给药600gkg-1d-1；空白对照E组灌生理盐水10lkg-1d-1；采用灌胃给药开场治疗，共用药10d。停药7d后处死所有裸鼠，取瘤块并分成约0.1g/份，福尔马林固定，石蜡包埋。常规HE染色。2.2检测裸鼠组织中hTERT，Bl-2,Bax蛋白的表达方法采用抗生素-生物素过氧化酶复合物S-P免疫组化法。组织切片0.4，55烤片过夜，常规脱蜡，高压修复抗原，PBS洗

9、涤3次。3%H22孵育，室温510in，H22要覆盖组织，PBS洗涤3次，滴加1:100的1抗，孵育1h。PBS洗涤3次。滴加生物素标记的第2抗体，37，1015in，PBS洗涤3次。DAB显色，用中性树脂封片。对照设置：阳性对照片染色步骤同上述；阴性对照片用PBS代替一抗；其余步骤同上。2.3检测裸鼠组织中凋亡指数表达(TUNEL法)组织切片，常规脱蜡，20g/l的蛋白酶K室温下消化20in，PBS洗5in3次。3%H22甲醇液阻断内源性过氧化物酶20in。PBS洗5in3次。3%牛血清白蛋白阻断20in，PBS洗涤，TUNEL反响液，60in，PBS洗3次，参加转换液，37，30in。PB

10、S洗涤3次。DAB显色，35in，苏木素染1020in，电吹风吹干，中性树脂封片。对照设置：阳性照片为加TUNEL反响液前用DNA酶消化30in，阴性对照片不加TUNEL反响液中的TdT，其余步骤同上。2.4免疫组化判断2.4.1对照染色每批染色的阳性对照片应显示为阳性，阴性对照片应显示为阴性，否那么整批片重染。2.4.2免疫组化染色阳性判断标准hTERT蛋白阳性反响位于胞浆和胞核中表达；Bl-2，Bax蛋白阳性反响位于胞浆内表达，呈棕褐色或棕黄色。2.4.3免疫组化染色分级在全片上、下、左、右、中各随机选取一个400倍视野，观察每个视野中阳性细胞的染色强度及该强度细胞占视野中所有癌细胞的百分

11、率。分级：按阳性细胞占总细胞数的百分率分4级，I级：5%25%；II级：26%50%；III级：51%75%；IV级：75%。5%作为阳性标准，5%作为阴性标准。阳性细胞的染色强度分为4级：1级：；2级：+；3级：+；4级：+。各阳性对照片的染色强度定为4级作为参照。一个视野的免疫组化染色得分6=该视野中的各种染色强度与该强度阳性细胞的百分率级别的乘积之和，即染色强度为1级的阳性细胞百分率级别1染色强度为2级的阳性细胞百分率级别2染色强度为3级的阳性细胞百分率级别3染色强度为4级的阳性细胞百分率级别4。该组织的免疫组化染色综合得分=5个视野的免疫组化染色得分之总和5。2.4.4细胞凋亡判断及记

12、数凋亡细胞核固缩呈圆形或椭圆形、蓝黑色，染色体沿核膜形成半月状或新月状，局部核凝固成致密小圆球形。光镜下随机选取5个以上高倍视野，每个视野不少于1000个细胞，按阳性细胞占细胞总数的百分率作为凋亡指数。2.5统计学分析用SPSS13.0统计软件，数据以均数标准差表示，两样本均数的比拟用t检验。多个样本均数的比拟，方差齐用q检验法，方差不齐用秩和检验；率的比拟用确切概率法；互相依存关系的检验用方差分析F检验。3结果3.1肿瘤组织病理学观察各组裸鼠解剖时均未见胸水、腹水；结合组瘤体最小，易剥离，血供较差，切面灰白，并有液化坏死区域。显微镜下见对照组癌细胞生长旺盛，形成癌巢，细胞形态不规那么，大小不

13、等，核大呈圆形或卵圆形，核膜增厚，核分裂相较多。药物作用后结合用药D组癌细胞呈大片坏死，构造不清，大局部癌细胞崩解，偶见剩余的癌细胞，间质纤维化，角质物质增多癌组织发生退行性变化，高剂量A组、低剂量B组及常规治疗组癌细胞变性坏死，偶见核分裂相，局部癌细胞核固缩，肿瘤退行性变较对照E组明显。各组HE染色见图1。3.2裸鼠肿瘤组织hTERT蛋白表达hTERT蛋白阳性表达大局部在胞浆，少局部在胞核，见图2。染色综合得分比拟见表1。各用药组与对照组比拟，有统计学差异P0.05；用药组间两两比拟，有统计学差异P0.05。表1裸鼠肿瘤组织hTERT蛋白免疫组化染色综合得分略转贴于论文联盟.ll.3.3裸鼠

14、肿瘤组织Bl-2蛋白表达Bl-2蛋白阳性表达在胞浆，见图3。染色综合得分比拟见表2。各用药组与对照组比拟，有统计学差异P0.05；用药组间两两比拟，有统计学差异P0.05。表2裸鼠肿瘤组织Bl-2蛋白免疫组化染色综合得分略3.4裸鼠肿瘤组织Bax蛋白表达Bax蛋白阳性表达在胞浆，见图4。染色综合得分比拟见表3。各用药组综合得分高于对照组，有统计学差异P0.05；用药组间两两比拟，有统计学差异P0.05。表3裸鼠肿瘤组织Bax蛋白免疫组化染色综合得分略3.5裸鼠肿瘤组织凋亡指数的变化表达凋亡细胞核固缩呈圆形或椭圆形、蓝黑色，染色体沿核膜形成半月状或新月状。局部核凝固成致密小圆球形，见图5。凋亡指

15、数的变化见表4，其直方图，见图6。各用药组与对照组比拟，有统计学差异P0.05，A组与B组、A组与组、B组与D组、组与D组相比，有统计学差异P0.01。凋亡指数：结合用药D组高剂量A组顺铂常规化疗组低剂量B组对照E组。3.6裸鼠组织不同组hTERT，Bl-2及Bax染色综合得分比拟根据表13，将测定各蛋白表达的结果汇总，获得直方图。见图7。表4裸鼠肿瘤组织凋亡指数表达略从图7结果可知，hTERT与Bl-2表达：结合用药D组高剂量A组顺铂常规化疗组低剂量B组对照E组；Bax表达：结合用药D组高剂量A组顺铂常规化疗组低剂量B组对照E组。4结论细胞凋亡(apptsis)是细胞在一定生理或病理条件下，

16、遵循自身的程序，自我完毕生命的过程。它是一个主动的、高度有序的、多基因控制的、一系列酶参与的过程，Bl-2，Bax是与凋亡最相关的调控基因。Bl-2最初是从人的滤泡性B细胞淋巴瘤中别离出来的，它定位于人第18号染色体，在淋巴瘤中极易发生染色体易位t14；18，使Bl-2与14号染色体上IgH基因并列导致过度表达，是至今为止研究最深化、最广泛的凋亡调控基因之一。Bl-2基因表达产物是一种细胞内膜蛋白，主要位于线粒体内膜、内质网和核膜3。通过抵抗多种形式的细胞死亡，延长细胞寿命，使细胞数目累积增多而促进肿瘤的形成。本实验结果显示，裸鼠肿瘤组织空白对照组Bl-2染色综合得分最高，随着汉黄芩素和顺铂作

17、用后抑瘤率的增强，Bl-2染色综合得分下降，说明Bl-2与肿瘤形成有关。Bl-2的抗凋亡机制有以下几种可能：Bl-2具有膜转运功能，能抑制细胞内质网a2+的释放，而细胞凋亡中DNA消化需要a2+依赖性核酸内切酶参与，推测Bl-2可通过改变细胞器的a2+来抑制凋亡4。Bl-2可以抑制线粒体膜通透性转运孔开放和维持线粒体跨膜电位，进而阻止线粒体内细胞色素和凋亡诱导因子的释放，从而抑制凋亡5；Bl-2通过其BH4构造与ed-4/Apaf-1结合，扣押Apaf-1/apase-9复合物或抑制其形成，进而抑制凋亡6。本实验发现裸鼠组织经药物作用后，随着药物抑制肿瘤作用的进步，Bl-2蛋白表达逐渐下调，与

18、凋亡指数变化的表达呈相反变化趋势，可能与汉黄芩素抑制Bl-2基因表达有关。Bax是1993年克隆成功的一种基因，其翻译产物与Bl-2蛋白大约有21%的氨基酸序列同源，也被称为Bl-2家族成员之一，其作用与Bl-2相反，能促进细胞凋亡7。Bax蛋白广泛分布于人体许多细胞和组织中，而在多数肿瘤组织及细胞系中表达下降8，在肿瘤形成过程，Bax大量激活或表达，通过促进细胞凋亡，抑制肿瘤形成。有研究发现转染Bax基因不仅可使多种细胞发生凋亡，而且可使放射线和化疗药物等许多因素诱导细胞凋亡9。本实验发现，随着药物抑制肿瘤作用的增强，Bax蛋白染色综合得分增加了，裸鼠组织Bax蛋白表达与凋亡指数变化的表达呈

19、同向变化趋势，可能与汉黄芩素促进Bax基因表达，从而诱导了细胞凋亡有关。肿瘤的发生，一方面源于肿瘤细胞过度增殖，另一方面与细胞凋亡相对缺乏有关。端粒酶与凋亡的关系引起了人们极大的兴趣10。Fu等11通过对嗜铬细胞瘤细胞P12中的观察发现端粒酶活性随Bl-2表达增强而升高，Bl-2的抑制剂可使端粒酶活性迅速下降。张百红12等研究证明苦参碱能显著抑制SG-7901胃癌细胞的Bl-2的表达；凋亡抑制基因Bl-2可以调节端粒酶的活性，当Bl-2过量表达时，端粒酶活性增强；当Bl-2表达量下降后，端粒酶活性也下降。ahitsh等13研究说明，抗凋亡基因Bl-2过度表达和凋亡基因Bax表达下降可导致端粒酶

20、活性显著增加。本实验也发现，经汉黄芩素作用后随着浓度增加，抑瘤率的进步，凋亡现象逐渐明显，端粒酶hTERT蛋白、Bax蛋白表达逐渐下调，而Bl-2蛋白表达逐渐增强。端粒酶活性、hTERT蛋白的下调伴随Bax蛋白表达的增强、Bl-2蛋白表达的减弱，说明端粒酶与凋亡亲密相关。无限增殖是肿瘤细胞的生物学特征，增殖失控关键在于端粒酶的激活；同样凋亡调控功能失调也与肿瘤的形成有关，可以推测凋亡相关基因Bl-2，Bax直接或间接参与端粒酶活性的调控。下调端粒酶活性，同时也伴随细胞的凋亡，可能是药物对端粒活性的抑制和对端粒构造的破坏，启动了凋亡基因。然而端粒酶的活性调节是一个复杂的系统，汉黄芩素如何抑制端粒

21、酶活性、怎样调节凋亡相关基因如Bl-2，Bax而发挥作用机制仍不明确，需要我们进一步通过信号传导通路来证实。【参考文献】1黎丹戎,侯华新,张玮,等.汉黄芩素诱导卵巢癌A2780细胞凋亡及对细胞端粒酶活性的影响J.癌症,2022,228：801.2IshiaruK,NishikaaK,tT,elal.Tflavne2-glusidesfrsetellariabaialensisJ.Phyteheistry,1995,40(1):279.3ZazaiN,Brenner,arzI,etal.SubellularandsubithndrialdefatinfBl-2-likenprtEinssJ.ng

22、ene,1998,16(17):2265.4La,DubyakG,hen,etal.EvidenethatBl-2repressesapptsisbyregultingendplasiretiulu-assiateda2+fluexesJ.PrNatlAadSiUSA,1994,91(14):6569.5SusinSA,ZazaiN,asted,etal.Bl-2inhibitstheithndrialreleasefanapptgeniprteaseJ.JExped,1996,184(4):1331.6angHGandReedJ.ehanissfBl-2prtEInsfuntinJ.HistlHistpathl,1998,13(2):521.7SharaH,SenS,athur,etal.binedevaluatinfexpressinftelerase,survivin,andanti-appttiBl-2failyebersinrelatintlssfdifferentiatinandapptsisinhu