病原微生物设计性实验

1、对猩红热病原菌的研究研究内容摘要目的：初步设计实验对猩红热病原菌进行分离培养鉴定，研究其药敏实验，了解对该病的 预防及治疗。方法：从咽拭子获取并分离培养得纯种病原菌，通过直接涂片镜检、触酶试验、胆汁溶菌试验、糖发酵试验、杆菌肽敏感试验、链激酶试验、PYR式验等进行鉴别，最后进行药敏试验分析。结果：触酶试验、胆汁溶菌试验、糖发酵试验阴性；杆菌肽敏感试验、链激酶试验、PYR试验阳性。结论：猩红热的病原菌是A组B型溶血性链球菌。关键词：猩红热；A组B型溶血性链球菌；小儿；分离鉴定；药敏试验一、选题的目的和意义猩红热是由A组B型溶血性链球菌引起的急性呼吸道传染病，属于乙类传染病，临床特 征主要为发热、

2、咽峡炎、全身弥漫性鲜红色皮疹、疹后脱屑等，且病后可出现变态反应性心、 肾、关节并发症，对人体危害十分严重。该病一年四季都有发生，尤其以冬春之季发病为多。 猩红热发病多见于小儿，且以 28岁儿童居多，因此极易在幼儿园及小学中传播流行。在这 些范围内一旦有病例发生流行，将严重影响正常的教学秩序及生活秩序，极易引发较大的社 会影响。因此对猩红热的研究是十分有必要的。通过研究，我们希望了解猩红热的症状与类型、病原学特点、临床诊断、并发症及治疗 方法等，进而能初步设计实验对该病原菌进行分离培养鉴定，同时研究并掌握其致病力及药 敏实验，了解该病的预防措施及治疗方法，希望对以后的临床实践有所帮助。由于猩红热

3、更 易在冬春季节且在幼儿、儿童中传播，因此针对该病的研究可以帮助我们设计并实施有效的 防护措施对其进行积极的预防和控制，如及时隔离患者并进行有效治疗，讲究室内卫生和注 意通风等。同时，对猩红热病原学的研究可以让我们更好的做到精确诊断、对症下药、正确 治疗、及时解除患者病痛。因此，我们小组选择了这个课题，并认真分工合作，查找资料进 行研究，完成了此次报告。二、国内研究现状A 组 B 型溶血性链球菌（beta . haemolytic group A Streptococcus isolates , GAS区 称为酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）,是一种常见的致病性化脓性

4、革兰阳性球菌，经 常侵犯上呼吸道黏膜上皮表皮等浅表部位，引起咽扁桃体炎、猩红热、肺炎及脓疱病等疾病； 少数情况下可致坏死性筋膜炎、败血症、链球菌中毒性休克综合征等及患者生命的侵袭性疾 病；迟发性GASS染后非化脓性疾病，如急性风湿热及链球菌感染后肾小球肾炎等也很常见。 近年来严重侵袭性GASS染在欧美一些国家再次增多，人类开始重新关注GASS染问题。2）。GAS的外毒素包括红疹毒素和细胞溶解毒素（链球菌溶血素s和0）,红疹毒素除了与各种免 疫反应及细胞反应有关外，还能通过增强机体对链球菌各种产物的超敏反应引起致热反应及 皮肤红斑反应。猩红热分三型：普通型，在流行期间 95%患者属于此型，近年来

5、症状更见轻微，大部分患者仅有低热、轻度咽痛，皮疹稀少，极不典型且消退快、脱屑也少，但仍可发生变态反 应的。肾小球肾炎及风湿性关节炎； 中毒型，以毒血症为主要表现如高热，剧烈头痛，繁 呕吐，神志不清，1、2天内可发生中毒性心肌炎和感染性休克，皮疹显著迅速遍布全身，呈 暗红色或出血性，休克时皮疹常不明显，应及时救治；脓毒型，咽部症状明显，渗出物多 有假膜、水月中，病原菌扩散形成化脓性病变或进入血中全身播散引起脓毒血症，此时病死率 高；外科型包括产科型，多为外伤感染。 今年猩红热患者较多，随着生化指标检测范围的扩大，发现猩红热热患者肝功能变化明 显，笔者认为猩红热患者细菌感染后，各器官细胞受损，引起

6、血清 eOALY AST,ALR LD十L、 TB邵增高，另一方面各种抗生素的大剂量使用，勿必导致肝细胞损坏，各种酶潘陛增加，而 且猩红热症状消失后，各种酶仍持续异常一段时间，提示临床治疗猩红热的同时监测肝功能 是必要的，必要时保肝治疗 。猩红热的耐药问题也需重视，导致我国儿童发生猩红热的GAS寸大环内酯类抗生素及四环素 呈现高水平耐药和高耐药率；台湾学者认为猩红热发病率的变化与菌株的毒力因子、环境因 素及抗生素的使用等多种因素有关(6,7) o(1)杨永弘，沈叙庄.重视 A族链球菌和相关儿科疾病的研究J .临床儿科杂志.2006, 24(6) : 443_444.(2)LiangY , Sh

7、en X, Huang G et al . Characteristicsof Strepto COCClpyogenesstrains isolated from Chinesechildren with scarletfeverJ. Acta Paediatr , 2008, 97(12) : 1 68l-1 685Jing HB, Ning BA, Hao HJ, et a1. Epidemiologicalanalysis ofgroup A streptococci recovered from patientsin ChinaJ . J.Med Microbiol , 2006。5

8、5(Pt 8) : 1 101 一 l 107 .张志宇 张义强110006辽宁沈阳市第六人民医院 021 122内蒙呼伦贝尔市大雁医院有限公司doi : 10. 3969/j . issn . 1007 614x, 2010l8 , 082当代医学 2010年 9fl 第 16卷第 26期总第 217期Contemporary Medicine , Sep. 2010, Vo1. 16 No. 26 Issue No. 217doi ：10. 3969/j . issn . 1009 4393 . 2010. 26. 078Brenciani A , Baceiaglia A , Veeeh

9、i M , et a1 . Genetic Elements Carrying erm(B)in Streptococcus pyogenes and Association withtet(M)Tetracycline Resistance GeneJ. Antimierob AgentsChcmother , 2007, 5l(4) : 1 209 1216.(7 ) Koh EH, Kim S , Lee NY. Decrease of erythromycin resistance in group A streptococci by change of cmm distributio

10、nJ . Jpn J Infect Dis 2008, 61(4) : 261-263 .三、拟采取的技术路线及实验方案技术路线：咽拭子平板划线法*分离培养血琼脂平板 肉汤血清纯化增菌鉴定方法革触胆链杆PYR糖兰酶汁激菌实发氏实溶酶肽验酵染验菌实敏实色实验感验验实验药敏试验实验方案：1、病原菌的分离培养分离纯种的病原菌【方法】37 c孵育24小时将咽拭直接接种在血琼脂平板，采用平板划线法，划线完毕后，盖好平板, 后，观察并挑选单个菌落接种。纯化增殖病原菌【方法】取典型菌落接种于另一血琼脂平板，接种完毕后，37c孵育24小时，观察分离的单个菌落的形态、大小、颜色、边缘、光滑度、透明度、湿润度、溶

11、血情况等。取典型菌落接种于液体培养基，接种完毕后，37c孵育24小时，观察生长状况，注意生长数量、浑浊度、有无表面及沉淀生长。2、病原菌的鉴定直接涂片镜检【方法】取病原菌直接涂片进行革兰染色，镜检观察细菌的染色性、大小、形态、排列，进行初步诊断。触酶试验【材料】试剂3 %过氧化氢溶液【方法】取洁净玻片一张，中央划线分离，滴加过氧化氢一滴，取病原菌于其中磨匀，约30秒后观察有无气泡出现，有气泡出现为阳性，无气泡出现为阴性。用生理盐水作对照，从而判断触酶试 验阴阳性。胆汁溶菌试验【材料】试剂10 %去氧胆酸钠溶液【方法】取病原菌液加入试管中，再加入10 %去氧胆酸钠溶液，摇匀后置 37c水浴103

12、0min,试管 内溶液变清为阳性，试管内溶液仍浑浊为阴性。用生理盐水作对照，从而判断胆汁溶菌试验阴 阳性。杆菌肽敏感试验【材料】杆菌肽纸片【方法】取典型菌落的菌液涂布于血平板上，用灭菌银子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片置于上述平板上，36c培养18-24h,如有抑菌圈出现即为阳性。用已知的阳性菌株做对照，从而判 断杆菌肽敏感试验阴阳性。链激酶试验【材料】试剂草酸钾血浆、0.25%氯化钙0.25mL【方法】吸取草酸钾血浆0.2mL,加0.8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入病原菌肉汤培养物0.5mL及0.25% 氯化钙0.25mL,混匀，置于36c水浴10min,血浆混合物自行凝固，观察凝块重

13、新完全溶解的 时间，完全溶解为阳性，如24h后不溶解即为阴性。用已知的阳性菌株作对照，从而判断链激 酶实验阴阳性。糖发酵试验【材料】培养基 菊糖发酵培养基试管一支【方法】将病原菌接种于菊糖糖管中，37c培养1824小时，观察结果，如指示剂变黄，小管内有气 泡形成为产酸产气，无气泡形成为只产酸不产气，指示剂无变化为不分解。PYR实验【方法】L-叱咯酮B紊胺反应实验，通过反应产物和试剂产生的产物显色或呈现荧光而快速诊断。3、病原菌的药敏试验【方法】即抗生素敏感试验。按琼脂扩散法进行。挑取 45个纯化菌落制备菌悬液，浓度为0. 5麦氏单 位，用无菌棉拭子沾取该菌液，均匀涂布于 MH血平板上，待干后，

14、于每块平板贴23张药敏 纸片，24h培养后，用卡尺测抑菌圈直径。十种抗生素分别是庆大霉素、青霉素 G头抱睡咻、 环丙沙星、头抱嚷匹、苯口坐青霉素、去甲万古霉素、氨苇青霉素、红霉素及头抱三嗪。四、预期结果1、病原菌的分离培养分离纯种的病原菌划线平板中形成大量的单个细小菌落。纯化增殖病原菌血琼脂平板上形成较多的灰白色、表面光滑、湿润、 边缘整齐、直径0.50.75mm的细小菌落。菌落周围形成一个24mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环。菌落在血清肉汤管底呈絮状沉淀。2、病原菌的鉴定直接涂片镜检细菌为球形或椭圆形，直径 0.61.0um。呈链状排列，长短不一。无芽抱，无鞭毛。培养 早期形成透明质酸的荚膜，随着培养时间的延长，荚膜消失。初步诊断为链球菌属。触酶试验原理：含有触酶的细菌能催化过氧化酶，放出生态氧，继而形成氧分子，出现气泡。若不含有，则无气泡产生。结果：30秒后无气泡产生，根据生理盐水对照组可判断为触酶阴性。胆汁溶菌试验原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，不溶解 A群链球菌，可作为鉴别依据。结果：试管内菌液仍较浑浊，未变澄清。因此为胆汁溶菌试验阴性。据此可以得出此病原 菌不是肺炎链球菌。杆菌肽敏感试验原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其他群链球菌绝大多数对其耐药。结果：培养1824h,出现抑菌环，根据阳性菌株对照可判断，为阳性。初步诊断为 A群溶 血性链球菌。链