基因克隆(包括DNA提取技术步骤)

1、基因克隆DNA克隆是指在体外将目的基因或DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，又称为重组DNA技术。DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等。一DNA的提取二目的DNA片段的获得（酶切）三体外重组LB培养基的配制大肠杆菌感受态细胞的制备载体的选择导入受体细胞重组子的筛选1插入失活法实验一DNA提取取0.5克以下的鱼类组织或20ul血液：1准备1.5ml离心管，加入500ul裂解液，取组织放入离心管，破碎。（常温操作）2恒温箱裂解

2、，55C。30min。3加等体积Tris饱和酚（酚：氯仿：异戊醇25：24：1），先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g10分钟。（注意酚在油层下面）4取上清（把枪头去掉部分，注意液面。蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而位于上层水相中），加入等体积CI（氯仿：异戊醇24：1），先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g10分钟。5汇集上清，加2倍无水乙醇（-30度保存），颠倒混匀可观察到絮状DNA。在-30度冰箱沉淀30min。离心4度12000g10分钟。6弃去上清，75%乙醇洗涤，7500g离心5分钟。7重复一次上述操作。在无菌台干燥半小时，乙醇挥发。溶解于200ul

3、ddwater。9定量DNA。裂解液的配制1ml体系200ul0.5MEDTA（PH=8.0高压灭菌。作用抑制酶的活性。）螯合DNA酶发挥作用需要的金属离子。50ul10%SDS（蛋白质变性剂）10ul1MTris-cl（PH=8.0高压灭菌）缓冲溶液5ulPK（消化）735ul灭菌超纯水a加入水中，在磁（约需颗粒），定容至。将溶液的值调至接近时，（，）将二水乙二胺四乙酸二钠（力搅拌器上剧烈搅拌。用调节值至分装后高压蒸汽灭菌。二钠盐加入才会溶解。实验二目的DNA片段的获得（酶切）获得了包含目的基因在内的DNA,这些DNA或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链cDNA

4、。由于基因组DNA较大，不利于克隆，必须将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法是核酸限制性内切酶消化。仪器：台式离心机、恒温水浴、取液器、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪试剂EcoRI,HindIII酶,DNA样品（浓度0.3|jg/|jl）1XTAE缓冲液。操作（一）EcoRI单酶切。取1支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入（ul）灭菌水13EcoRI缓冲液2DNA43ugEcoRI110U20ul体系。37C保温14小时，也可过夜。保温结束后65-70C10min灭活酶（如为热稳定性酶，则用氯仿抽提）。4，取10pl左右的反应液加入1卩1电泳加样缓冲液，电泳。目的片段回收。注意

5、：1，样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒。2,加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀。3，反应体系的体积要尽量少，要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10。为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA的浓度应很高，因此如底物DNA浓度过低则应进行真空浓缩。培养基的配制培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。含有酵母提取物、蛋白胨和C其中酵母提取物为微生物提供碳源、能源和磷酸盐，蛋白胨主要提供氮源，提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96c时溶化。琼脂在40T时凝固（高压灭菌融化琼脂糖），通常不被微生物分解

6、利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温不同而有所不同。培养基用来培养细菌，将其调至中性或微碱性，利于细菌生长繁殖。器材和试剂酵母提取物，蛋白胨，a琼脂，氨苄青霉素；锥形瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，细菌培养皿，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，试纸，记号笔，纱布，封口胶。000体系液体培养基：参考分子克隆实验指南在950ml去离子水中加入:TOC o 1-5 h z胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g摇动容器直至溶质溶解.用1mol/LNaOH（大约1ml）调pH至7.4.（适合E.coli的生长）用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.（全过程需

7、要2小时）锡箔。常温保存。氨苄青霉素，用无菌水配制成0溶液，置C冰箱保存。LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉。.称量按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨0、0放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。在烧杯中加入950ml去离子水，摇动容器直至溶质溶解用1mol/LNaOH（800ul）调pH至7.4，再用去离子水定容至1L。转移到试剂瓶中再加入加15g琼脂粉。高压灭菌。2抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到55C时（手可触摸）在超净台加入1/500体积50mg/ml抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。（

8、类似琼脂糖制胶）3.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。4保存：用封口胶封边，并倒置放于4C保存，一个月内使用。1kg=1000g1g=1000mg1mg=1000ug1ug=1000ng试验四大肠杆菌感受态细胞的制备（超净台）r是指细菌处于容易吸收外源的状态叫感受态。转化（质粒或以它为载体的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于C,低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的形成抗酶的羟基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经C短时间热击处理，促进细胞吸收复合物。将细菌放置在非选择性液体培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型得到表达，然后

9、将此细菌培养物涂在含氨苄青霉素的选择性固体培养基上。【仪器、材料与试剂】（一）仪器i超净工作台.低温C离心机.恒温摇床C180rpm4C冰箱.恒温水浴器二材料1氯化钙培养基（液体）大肠杆菌（）离心管.吸嘴、小指管试管、培养皿、锥形瓶等三）试剂.溶液（分子量110.98）灭菌后C保存。氨苄青霉素，用无菌水配制成溶液，置C冰箱保存。液体培养基。大肠杆菌感受态细胞的制备从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落接于含有液体培养基的试管中,7。180rpm振荡培养过夜。取菌液转接到一个含有液体培养基锥形瓶中，7180rpm振荡培养.将菌液转移到冰预冷的C,离心5.倒出培养液，将管倒置离，心液管中，冰上放置回收细胞

10、。以便培养液流尽。用冰冷的悬浮沉淀，立即放在冰上保温，离心，回收细胞。用冰冷的悬浮细胞务必放冰上。加入甘油至终浓度为15%；使用离心管分装细胞，每一份。此细胞为感受态细胞。7保存备用。本实验使用生物公司感受态大肠杆菌本实验使用克隆载体质粒是PGEM（R）-3ZF（+）VECTOR载体的选择基因工程的载体应具有一些基本的性质：1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。2）分子量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段。同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因A

11、mp）,以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。（蓝白斑法）DNA克隆常用的载体有：质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage），柯斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ssDNAphage），噬粒载体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC）等。从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。T7IEcoRISacIKpnl

12、AvalSmalBamHIXbalSallAcclHindiPstlSphlHindlllrttast1551136289084691222233344556PGEM（R）-3ZF（+）VECTOR酶切位点及复制起始点。本实验使用克隆载体质粒是PGEM(R)-3ZF(+)VECTOR产品介鉛产品规格目录号数量价格;元;pGEm-EZK-n去er2C?22?31681pGE2邕-3Zf(-V?:a-2OueP22611&49说明pGE2-3Zff-pGE2.-SZfC-Vsztcrt由pGEl養-辽戟体衍生而来，含有丝状噬菌体左的复制起点-载体上的P-半乳構昔酶的肽編码医中有哆克隆位点，哆克隆位

13、点旁边还含师n-R3H彖合酶启动子-选用合适的Emli菌株比如口口就能通过蓝白筛选的方法把s肽插入失活的重齟克隆直接鉴别出来.劣克隆位点区域含有一些单一的限制性位点，SacIK.ptc:AvalSmal.BamKLXba2;边&Acc；EincZ;PseLSphliaEuidUIopEEH-dZi(-湘载体除了fl起点的方向外，其它都呈一样的-因此可以作为标堆克隆截体初体那转录的模板也可用于制备环化ssDNAo特点蓝白谦选.能方便地鉴定重组克隆谨用此载袜能用于标淮克隆单强口戈仝制备必及在与哆克嗟区_域相连的5氏和?-RN煤合酶启动子的作用下进行体外转录方便多克隆区域的具有劣种限制性内切醜位点.

14、在克隆时可选_择哆种限制性臨n操作手册編号pGE2官-3Zf-)YsctorTshnizalBullstiiiTBOS5pGE2-3Zz(-)Vszem-T52htii:aLBulletinIB045储存条件:载怖储存于二眈,细弦菌株储存于-皿戏GstiBatikSE?-.TLAzcsstisnXuiubsi：-X553C&;:.-区厉北人实验五体外重组体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有粘性末端，用同一种酶切割载体的多克隆位点便可获得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通过T4DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为粘末端连接。当目的DNA

15、片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比粘端相连差些。外源与载体分子的连接就是重组，重新组合的叫重组子。重组的分子是在连接酶的作用下，有、存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源分子进行连接。连接酶有两种：噬菌体连接酶和大肠杆菌连接酶。两种连接酶都有将两个带有相同粘性末端的分子连在一起的功能，而且噬菌体连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，使两个平末端的双链分子连接起来。噬菌体连接酶催化连接反应分为步：首先，连接酶与辅助因子形成酶复合物；然后，酶复合物再结合到具有5磷酸基和3羟基切口的上.使腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应的温度

16、在37时有利于连接酶的活性。但在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。实验温度选择在C，连接过夜，既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用a互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。载体具有一段大肠杆菌P半乳糖苷酶的启动子及其编码肽链的序列，此结构称为c基因。c基因编码的a肽链是0半乳糖苷酶的氨基端的短片段个氨基酸，宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的0半乳糖苷酶分子。基因编码的a肽链与失去了正常氨基端的0半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为a互补。由a互补而形成的有功

17、能活性的0半乳糖苷酶，可以用溴氯吲哚0半乳糖苷显色测定出来，它能将无色的化合物切割成半乳糖和深蓝色的底物澳靛蓝。因此，任何携带着基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种0半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的0半乳糖苷酶，在异丙基硫代0半乳糖苷诱导后，在含有的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源片段插入到位于中的多克隆位点后，就会破坏a肽链的，从而不能合成与受体菌内突变的0半乳糖苷酶相互补的活性a肽，而导致不能形成有功能活性的0半乳糖苷酶，含有重组质粒载体的克隆是白色菌落。(一)设备，恒温摇床2恒温水浴器3恒温培养箱噬台式离心机5低温离心机(二，材料.胰蛋白胨.酵母提取物.氯

18、化钠.氨苄青霉素.氯化钙二甲基甲酰胺7限制性内切酶连接酶大肠杆菌，PGEM(R)-3ZF(+)VECTOR，2培养皿，3接种针噬玻璃涂棒，5试管，氨酒精灯，镊7子、牙签等三，试剂(分子量98.14)高压灭菌，常温保存。:将溶于二甲基甲酰胺，配成，不需过滤灭菌，分装小包装，避光贮存于C。:取溶于双蒸水中，再用双蒸水补至，用|J滤膜过滤除菌，每份，贮存于C。质粒的制备：PGEM(R)-3ZF(+)VECTOR。制备重组i在灭菌的管中，质粒酶切。在另一无菌管中，全基因组酶切。反应完毕后各取J酶解液做电泳分析。基因组做胶回收。C保存。余下的质粒酶解液加入体积的溶液，再加倍体积的无水乙醇(C保存)C冰箱沉淀AC离心，弃上清加常温乙醇洗沉淀物再离心，去上清，真空干燥后，加J灭菌水。连接试验体系超净水酶切质粒5酶切连接酶仪上4过夜。在琼脂糖上观察连接产物，对照组是质粒酶切产物和基因组酶切产物。实验六转化实验载体DNA分子上