实验五 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞

1、实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化 一实验目的.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。.掌握质粒DNA转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖甘酶基因 插入失活选择重组质粒DNA的原理。二实验原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长到某一阶段，最易接受外源DNA而实现转化的 一种特殊生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质 和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞外表正电荷增加，通透性增加，形 成能接受外来的DNA分子的受体位点等。细菌中能发生感受态细胞是占极少 数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生

2、。目前对感受态细胞能接受外来 DNA分子的本质看法不一。主要有两种假说：1局部原生质体化假说细胞外表的细胞壁结构发生变化，即局部失去细 胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进细胞。证据有：（1）发芽的 芽抱杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体 DNA转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。2酶受体假说感受态细胞的外表形成一种能接受DNA的酶位点，使 DNA分子能进入细胞，证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制 转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数 期的中早期出现；（3）别离到激活蛋白或感受态因子，能使非感受态

3、细胞转变为 感受细胞。目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但研究说明以下操作可以提 高转化效率：（1）大肠杆菌受体菌在对数生长初期，即培养浓度为OD6oo=0.4最 好；（2）菌体用冰预冷的CaCb洗涤两次，效果较好；（3） 0.1 MCaC12处理可 获得最高的转化效率；（4）菌体在pH6.0的溶液悬浮时最为适宜；（5）经CaCb 处理过的细胞对外表活性剂非常敏感，所用的玻璃离心管必须清洗干净；（6）在 冰浴条件下，把细胞悬浮在pH6.0的0.1 M CaCl2中放置12-24 h,转化率能够提 高几十倍。但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平；（7）用二甲基亚飒和 二筑基苏糖醇处理

4、感受态细胞可以进一步提高转化效率。（二）重组DNA的转化原理作为受体的大肠杆菌JM109或DH5a,必须是重组缺陷、限制和修饰系统三 缺陷型（忆c-衣用左），保证外源DNA导入受体细胞后不会发生遗传重组，不会 被受体细胞内限制性内切酶所降解，同时也不会被甲基化酶所修饰，从而保证外 源DNA分子在受体细胞中的稳定性。DNA分子转化过程分为：（1）吸附完整的双链DNA分子吸附在受体 菌外表的DNA结合蛋白上；（2）转入双链DNA分子解链，单链DNA分 子进入受体菌，另一链降解；（3）自稳外源质粒DNA分子在细胞内复制成 双链环状DNA； （4）表达供体基因随同复制子同时复制，并被转录和翻译;能被转

5、化进受体细胞的DNA分子比率极低，通常只占DNA分子的0.01%, 优化转化的条件能够一定程度上提高转化率。（1）受体菌细胞与DNA分子两者 比例在1.6x108细胞：1微克DNA分子（4.3Kb）左右转化率较好，且DNA连 接液的体积不超过感受态体积的10%;DNA分子与细胞混合时间为1小时最正确，且连接反响一定保持在冰浴条 件下操作，温度改变影响转化效率；（3）不同转化菌株热处理时间不同；（4）热 处理后，要迅速加进1 ml预热的LB以使表型表达，延迟加LB,将使转化率 迅速降低；（5）铺平板条件会影响转化率，防止反复来回涂布，因为感受态细菌 的细胞壁有了变化，过多的机械压涂布将会使细胞破

6、裂。影响转化率。（三）筛选的原理转化子的筛选主要基于抗性筛选和颜色筛选两个方面。由于大肠杆菌不能耐 受氨苇青霉素，而携带外源基因进入受体细胞的pUC系列载体上带有氨苇青霉 素的降解基因（Ap）,因此只有转化菌才能在含有氨苇青霉素的LB平板生长。 由于导入了空载体的受体细胞也能生长，因此抗性筛选不能鉴别载体上是否整合 了外源基因，需借助于颜色筛选对转化子进行筛选，JM109或DH5a是0 一半乳糖昔酶编码基因的缺陷型（/acZ）,其基因组上 的仅含有lacZC端片段（也称作W片段）的编码序列。pUC载体上那么携带了 lacZ 的调控序列operator和/acZ的N端146个氨基酸的编码序列la

7、cZ/ （其编码产 物为也称作a肽段），这个编码区中插入了一个多克隆位点，但并没有破坏lacZ, 的阅读框架，不影响a肽段的活性。假设空载体导入受体细胞，a肽段与受体细胞 的W片段发生a-互补，形成有活性的p 一半乳糖甘酶，降解培养基中的生色底 物X-gal（5-澳-4氯-3引噪-0-D-半乳糖甘），菌落变为蓝色（即为篮斑）；假设外源 基因整合到的多克隆位点，破坏/acZ，的开放阅读课，其不能产生有功能 的0半乳糖甘酶a肽段，不能降解X-gaL菌落为白色（白斑）。因此通过蓝白 斑既可筛选外源基因是否整合到载体上，一并导入了受体细胞。另外，pUC载体上a肽段的表达还必须加入乳糖类似物IPTG（异

8、丙基硫代 -B-D-半乳糖昔）。因为受体细胞基因组上编码的阻遏蛋白结合到operator, 阻遏a肽段的表达。IPTG与阻遏蛋白结合改变其构型，使得a肽段的表达。三实验仪器、材料和设备（一）实验仪器和用具1恒温振荡器2分光光度计3低温离心机4制冰机5水浴锅6普通冰箱7恒温培养隔8平皿和涂布棒9酒精灯500 ml三角烧瓶15 ml试管12移液管13 2 ml离心管（二）实验材料大肠杆菌 JM109 或 DH5a （rec rk mk）pUC载体（三）实验试剂LB液体培养基（新鲜配置，湿热灭菌）100 mmol/ L CaCk （0.22 11m 滤膜过滤除菌）3氨苇青霉素溶液（50mg/ml）D

9、NA连接反响液X-gal储液（20 mg/ml）:用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20 mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏，储存于-20。6IPTG储液（200 mg/ml）:在800似蒸僧水中溶解200 mg IPTG后，用蒸储水定 容至1 ml,用0.22 |im滤膜过滤除菌,分装于eppendorf管并储于-20。7含氨节抗生素的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至 60左右，加入Amp储存液，使终浓度为50 （Lig/ml,摇匀后铺板。8含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50%/ml Amp的LB平 板外表加40 ml X-gal

10、储液和4 pd IPTG储液，用无菌玻棒将溶液涂匀，置于37 下放置3-4小时，使培养基外表的液体完全被吸收，备用。9 SOC培养基四、实验步骤（一）大肠杆菌感受态细胞制备1接种-70C冻存的大肠杆菌于LB平板上，划线别离单克隆，37恒温培养箱 中培养过夜；2取单克隆菌落接种于装有3 ml LB的15 ml试管中，于恒温振荡器上，37、 250 rpm振荡培养过夜（约16小时）；3无菌条件下，用移液管取过夜培养液1 ml接种于新鲜的lOOmlLB中（500ml 三角瓶，接种量按为1:100）于恒温振荡器上250rpm、37培养2-3小时。4取少量培养物，以未接种的LB作空白对照在分光光度计上测

11、OD6oo的光密度 值，约为0.30.5左右；5无菌条件下吸取2 ml菌液到2 ml灭菌离心管中，冰上放置10 min,平衡后置 于台式低温离心机上4度1500 g离心10 min； 6无菌条件下，倒去上清，快速在滤纸上倒扣几秒钟使培养基流干。加入预冷的 lOOmmol/LCaCb溶液1 ml,用剪去尖端的无菌枪头轻轻吸冲底部沉淀，使菌体 均匀重悬后冰浴中放置30 min；7 4度1500 g离心10 min,小心侧倒掉上清CaCb，留沉淀菌体;9加入200ul 100mmol/LCaCb的溶液并均匀重悬，置于冰上作为转化的受体菌 液。此制备的感受态细胞应在此步后1小时至24小时内使用，效率比

12、拟高。10.在事先制备好的含50 |ig/ml mp的LB平板外表加40 ml X-gal储液和41il IPTG储液，用无菌玻棒将溶液涂匀，置于37下放置3-4小时，使培养基外表的 液体完全被吸收，备用。（二）重组DNA转化1从-70C取一支大肠杆菌感受态细胞，加入5-10似的连接液，混匀，置冰浴中30 mine2冰浴后，将正在转化反响的细胞悬浮液加入已调好42的的恒温水浴槽内， 保温1-2分种。3迅速倒入1 ml LB培养液，冰浴1-2 min,然后37c水浴45 min,每10 min翻 转1次。4用移液器取0.1 ml的转化菌液直接涂布含50 ng/ml Amp、40 ml X-gal

13、储液和4 |il IPTG储液LB固体平皿上，共涂布三个培养皿。5用移液器取未经转化的受体大肠杆菌感受态菌液0.1 ml直接涂布于含50%/ml Amp、40 ml X-gal储液和4出IPTG储液LB固体平皿上，作为受体菌对照。6将涂布培养皿先放室温15 min左右，使涂布上的菌液干燥不会流动。然后倒 置放于恒温箱中37培养过夜。7第二天取出培养皿，观察对照平皿和转化平皿菌落情况。对照平皿因受体菌对 Amp敏感,故不能在含Amp的培养基上生长。转化平皿是否有蓝色和白色菌落 生成？如果长出蓝色菌落，说明自连的载体pUC18质粒已转入受体菌，但目的 基因没有接入载体。如果长出白色菌落，说明目的基因已接入载体，重组质粒的 转化子因此丧失了供半乳糖甘酶活性，在x-gal和ITPG存在的生色诱导培养基 上只能形成白色菌落。五考前须知1所用器具必须洁净，不能用去污粉等有机溶剂洗涤器皿；所用的CaC12等试剂 均需是最高纯度的，并用最纯洁的水配制，最好分装保存于4。2三角瓶中培养基的装量要小于烧瓶体积的1/5,保证菌体有氧代谢。厌氧代谢 培养的细菌感受态效率降低。3培养