灭菌与空气净化课件

1、 专题三 灭菌工程与空气净化 一、灭菌的原理和方法 消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）的区别？ 消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，巴氏消毒法，是将物料加热至60维持30min，以杀死不耐高温的微生物营养细胞。 灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。 防腐（antisepsis） 防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。 （1）低温 （4）高渗 （

2、2）缺氧 （5）高酸度 （3）干燥 （6）防腐剂 1.化学试剂灭菌法 甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒2.射线灭菌法3.干热灭菌法 电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：无菌室、接种箱常用烘箱，灭菌条件：160下保温1h 适用范围：金属或玻璃器皿4.湿热灭菌法 利用饱和蒸汽灭菌，条件：121，30min 适用范围：生产设备及培养基灭菌5.过滤除菌法 利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气 6.火焰灭菌法 火焰 适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口 二、灭菌工程1、目的： 1）消除罐内死角，确保下一批发酵的成功 2）杀灭与罐直接相通的各管路、阀门的微生物

3、 3）杀灭上批发酵的活的微生物，减轻环境污染 一）空罐灭菌2、步骤： （热蒸汽法）1）先彻底清洗作用：a）有利于消除死角 b）免于料受热（尤其是干热的部位）干 焦于罐体、管或阀门2）从底部通入蒸汽3）排冷气4）升压 打开各个需灭菌的管路、放气阀等（如 接 种管、取样管、空气进管、流量计等）5）保压 通常1kg/cm2, 3060min6) 降温 关闭各放气阀，切断汽源，慢慢放气； 或自然冷却，或泵循环水加速冷却Notes: a）确保无死角产生 b）也可采用甲醛蒸煮或熏蒸的方法 c）勿激碎视镜1）致死温度（Death temperature）杀死微生物的极限温度称为致死温度。下面介绍与热阻相关的

4、几个概念2）热力致死时间 (Thermal Death Time; TDT) 在特定条件、特定温度下，杀死某种微生物所需的最短时间。e.g 伤寒杆菌58 30min 变形杆菌55 60min3）D值 -利用一定温度进行加热, 90%的活菌被杀死时所需的时间(min)即为D值。又称1/10衰减时间。 DD = 10 min0 10 20 30 40 50 60加热时间 (min)10510410310210106残 存 活 细 胞 数残存活细胞曲线对数残留定律的概念： 数学表达式：- dN/d = NN 培养基中活的微生物个数； 时间（s）; 比死亡速率（s-1） (死亡速率常数)dN/d 微生

5、物的瞬间变化率，即死亡速率 对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。 若开始灭菌（ = 0）时，培养基中活的微生物数为N0 = 2.303 logN0/N /- dN/d = NlnN/N0 = - 积分2.303logN0/N = or = 2.303 lgN0/N /可见灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度（残留菌数N）和值 在培养基中有各种各样的微生物，不可能逐一加以考虑。一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据。 灭菌程度，即残留菌数，如果要求完全彻底灭菌，即N = 0，则 为，上式无意义，事实上也不可能。 一般取

6、N = 0.001，即1000次灭菌中有1 次失败。例： 有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每ml有2105个耐热细菌芽孢， 121时灭菌速度常数为1.8min1。求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。解： N0 = 40106 2105 = 8 1012 (个) N = 0.001; = 1.8 (min1) =2.303lgN0N=2.3031.8lg(81015)= 20.34 (min)Svante August Arrhenius was a Swedish physical chemist best known for his theory

7、 that electrolytes, certain substances that dissolve in water to yield a solution that conducts electricity, are separated, or dissociated, into electrically charged particles, or ions, even when there is no current flowing through the solution. In 1903 he was awarded the Nobel Prize for Chemistry.

8、= A eR TEArrhenius equationA 比例常数；E 杀死细菌所需的活化能，(E) （4.18 J/mol）;T 绝对温度，(K)R 气体常数，1.9784.18 J/(molK)e 2.71 (exp) = A eR TElg = + lgAE2.303RT以lg对1/T作图，得一直线，其斜率为-E/2.303R，截距为lgA，从斜率和截距科求得A和E值。1/Tlg截距 = lgA斜率 = E/2.303R培养基成分受热破坏是化学分解反应，为一级动力学反应：- dC / d = CC 对热不稳定物质的浓度, (mol/L); 分解速率常数 （s1）； 分解反应时间 （s）随

9、反应物质种类和温度不同在化学反应中，其他条件不变，和温度的关系也可用阿仑尼乌斯方程表示：= A eR TEA 比例常数；E 分解活化能，(E) （4.18 J/mol）;T 绝对温度，(K)R 气体常数，1.9784.18 J/(molK)e 2.71 (exp)1= A eR T1E2= A eER T2相除取对数ln21= E 1 1R T1 T2 在灭菌时，当温度变化，菌死亡速率常数和培养基成分破坏速率常数都变化。温度由T1升高到T2，值分别为：同样，灭菌时培养基成分的破坏也可得类似关系：ln2 1 = R T1 T2E 1 1ln(2 /1)ln(2 /1)EE上面两式相除，得由于灭菌

10、的E大于培养基成分分解的E名称E (J/mol)叶酸泛酸维生素B12维生素B1嗜热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌肉毒梭菌70.387.996.792.1283318343因此ln2/1ln2/1 即随着温度的上升，灭菌的速度常数的增加倍数大于培养基成分破坏的增加倍数。或者说，当灭菌温度上升时，微生物杀灭速度的上升超过培养基成分破坏的速度。 根据这一理论，培养基灭菌采用高温短时间的方法，有利于减少营养成分的破坏。 灭菌温度/ 灭菌时间/min 维生素B1破坏量/%100 400 99.3110 36 67115 15 50120 4 27130 0.5 8145 0.08 2150 0.01 13、菌的浓

11、度浓度越高，所需灭菌时间越长例如： 如肉毒梭状芽孢杆菌，在105湿热灭菌时间 芽孢杆菌数/ml 时间 (min) 9108 48 9106 36 9104 20 9102 14 9 2影响培养基灭菌的主要因素（continued）4、 培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性 因高浓度有机物会环绕细菌的四周形成一层薄膜，影响热的传入。 而高浓度的盐类、色素等则削弱其抗性影响培养基灭菌的主要因素（continued）5、泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去杀死其中潜伏的微生物； 易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。6、颗粒 颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌

12、难。影响培养基灭菌的主要因素（continued）三）分批灭菌（实罐灭菌）（一）操作1、在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的 分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干。 若已先行空罐灭菌，此步可不进行2、 预热向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至70左右。作用： 利于糊化；减少冷凝水的生成；减轻噪音有的工厂省却此步；需通过试验掌握冷凝水的生成量，确保培养基的浓度。3、开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽，升温。4、罐压达1kg/cm2 ( 0.1 MPa)时，按装在发酵罐封 头的接种管、补料管、消泡剂管等应排汽。升 温 阶 段5、保温 调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度 保持在一稳定水平，维持一

13、定时间。在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。保 温 阶 段6、保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀；待罐内 压力降至0.5kg/cm2左右时，向罐内通入无菌空 气，向夹套或蛇管中通入冷水，使培养基降至所 需温度。通入无菌空气的作用：加速降温；保持罐内正压降 温 阶 段ABCD升温 保温 降温小型罐升降温快，可忽略；但大型罐不可忽视min(二） 灭菌时间的计算V = V加热 + V维持 + V冷却 RT2 (E 2RT)V 加热 = t 加热 (T-T0)E2 RT2 (E 2RT)V 冷却 = t 冷却 (T-T0

14、)E2R ：气体常数；= 1. 986 卡/克分子KE ：耐热孢子致死的活化能；= 65000 卡/克分子T：灭菌维持温度； 121 （393 K）T0：开始计算灭菌效果的温度；100 （373 K） 1.9863932(65000 21.986 393)V加热 = 5 = 1.15 (393-373) 650002 1.9863932(65000 21.986 393)V冷却 = 5 = 0. 69 (393-373) 650002V = V加热 + V维持 + V冷却 = 1.15 + 15 + 0.69 = 16.6 (min) 例 1 小型发酵罐在120灭菌维持15分钟，由100 （1

15、00以下灭菌效果不计）加热至120的时间为5分钟，由120冷却到100的时间为3分钟，计算总的灭菌时间。例 如果灭菌条件不变，大罐由加热到需分钟；冷却至的时间为分钟；求大罐的维持时间。 1.9863932(65000 1.986 393)V加热 V冷却 = （ ） (393-373) 650002.min则大罐维持时间V维持 = V（V加热V冷却）16.6 9.2 = 7.4 min在不同规模的发酵罐中达到同样灭菌效果所需时间发酵罐规模（升） 维持时间（分） 200 17. 5 500 12. 6 5000 11. 3 50000 8. 8（三）分批灭菌的优缺点优点：不需专门的灭菌设备，投资少

16、、设备简单、灭菌效果可靠。对蒸汽的要求较低，一般3-4kg/cm2即可满足。缺点：在灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大中小型罐经常采用四）、培养基的连续灭菌 （连消） 将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却，进行灭菌。 温度 （） 时间 （min) 121 24.8 130 4.1 138 0.72 146 0.14 154 0.029 163 0.0061灭菌时间与温度的关系（以杀死细菌芽孢为准） 配料罐（兼作预热） 输料泵 连消塔（器）维持罐（管） 冷却器 发酵罐（一）连续灭菌流程1 配料罐 3 连消装置 4 维持罐 6 冷却装置1、预热可在专门的预热罐，也可用配料

17、罐兼作温度：一般预热至70左右预热的物料用泵泵入连消装置输料泵： 常用 旋涡泵、往复泵、螺杆泵旋涡泵往复泵螺杆泵2、加热常用连消装置有三类： 套管式连消器 汽液混合式连消器 喷射式加热器物料泵入加热器，培养基与蒸汽混合，温度迅速上升至130140套管式连消塔上疏下密，45小孔，孔径6毫米左右培养液流动线速度小于0.1m/s ; 在管内逗留时间为1520秒 汽液混合式连消器1 喷嘴 2 吸入口 3 吸入室 4混合喷嘴 5 混合段 6扩大管喷射加热器3、保温保温设备 （维持设备） 保温材料包裹 两种形式： 罐式；管式 1、维持罐连续灭菌时，关2开1；预热罐中的物料输送完后，关1开2。培养基的平均停

18、留时间 = V / FM-平均停留时间 （s）V- 维持罐的体积 （ m3）FM - 培养基的流量 （m3/s）Note: 培养基在维持罐的流动不可能非常均匀，可能产生沟流，造成一部分培养基在罐内的停留时间少于平均值。为保证灭菌彻底，在设计罐式维持器时，通常取平均停留时间的35倍。经验： 在灭菌温度为130时，实际平均时间可取10分钟；在140时则可取34分钟。2、管式维持器在设计管式维持设备时，须采用停留时间分布的概念，而不能采用单纯的停留时间。圆管内不同流动形式流体的速度分布情况 湍流 Vaverage = 0.82 Vmax 活塞流 Vaverage = Vmax 粘滞流 Vaverag

19、e = 0.5 Vmax 在管式维持器中，若培养基流动为活塞流，可根据维持管的内径、培养基的流量求出管长。 但实际上培养基不可能呈活塞流，当培养基处于粘滞留状态时，管内速度呈抛物线，管中心部位的最大流速为平均流速的2倍；若以平均流速确定管长，则会造成边缘部分的培养基过热（加热过长）。 确定维持管的长度，应采用扩散模型 ( Dispersion model) . （复杂，略）4、冷却喷淋冷却器板式冷却器真空冷却器喷淋冷却器结构简单；广泛使用板式换热器体积小，换热效率高；但流动阻力较大板式换热器板式换热器板式换热器原理图喷射加热-真空冷却连续灭菌系统（二） 连续灭菌的优缺点及注意事项1）可采用高温

20、短时灭菌，培养基受热时间短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；2）蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便。3）适于自动控制，降低劳动强度。缺点： 设备复杂，投资大优点：连消注意事项：1）连消前，应先进行空罐、维持罐（管）、冷却系统的灭菌；2）确保管路无渗漏；3）当培养基含有较大固体颗粒或有较多泡沫时，采用连消容易发生灭菌不彻底。三、空气除菌 一）空气过滤除菌流程 （1）空气除菌流程的要求 空气应具有一定的压力，过滤器要高效，设备尽量采用新技术，流程尽可能简化，降低动力消耗，工人操作简便，运转费用低。设备中要用无油润滑，否则有油雾，影响过滤效率。（2）流程分析空压机冷却分油水总过滤器分过滤器 1

21、、高空采风、两次冷却、两次分油水、适当加热流程 特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。空气第一次冷却到3035，第二级冷却至2025，经分水后加热到3035，因为温度升高，相对湿度下降。 2、冷热空气直接混合式空气除菌流程 特点 ：省去一级冷却和分离设备及空气再加热设备，简化了流程，使冷却水用量也降低了。压缩空气从贮罐出来分两路，一部分进冷却器，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合，使混合后的空气温度为3035，相对湿度为5060%。 3、高效前置过滤除菌流程在压缩机前设置一台高效过滤器，这样便可降低过滤器负荷（即多次过滤），达到空气除菌的要求。 二）对数穿透定律 1.

22、对数穿透定律通过滤层杂质数是随滤层厚度的增加而减少的，即 K1：过滤常数N0和N：一定体积的空气在除菌前后的总菌数（个）L：过滤介质厚度（m）滤层不能太厚，否则过滤阻力太大；过滤器直径不能太大，否则棉花添料不易填均匀，容易在某一地方形成短路。 穿透率： 为穿透滤层的微粒数与 原有微粒数的比值。 如果要求每1000次使用周期中只允许有一 个杂菌通过，即经过滤后要求无菌度，且假设原有颗粒数为5000 (个/m3),则其中 为分批发酵的时间或过滤器的无菌周期（h） 为通风量（m3/min）除菌效率: 填充率： 空隙率： 一般采用过滤效率为90%时的滤层厚度作为对比基准。 即 微粒的90被捕获 假 设

23、 a. 空气中微粒在滤层中为均匀递减，即每一纤维薄层除去同样百分率的杂菌。 b. 空气中的微粒与纤维表面接触后即被吸附。 c. 过滤器的过滤效率与空气中的微粒浓度无关。 d. 过滤介质每根纤维的空气流态，因其它邻近纤维的存在而受影响。2对数穿透定律的校正 对数穿透定律是以上面提到的四点假设为前提推导出来的。这只符合滤层较薄的情况。但在实际中，当滤层加厚时，值不是常数。也就是说，空气在过滤时微粒含量沿滤层不是均匀递减，所以以上推出的对数穿透定律就不适合于较厚滤层的情况，需要进行校正。三） 过滤介质 1.棉花：品种不同，要求新鲜，纤维长而疏松， 贮存时间长的话，纤维易断，易堵塞。 2玻璃纤维：阻力损失小 3活性炭：强度高，表面积大，空隙大，阻力小，只有棉花阻力的1/12。4超细玻璃纤维纸 超细玻璃纤维纸是上好的无碱玻璃，喷吹成丝状纤维，再以造纸法做成。该过滤为高气速过滤，气流速度越高，效率越高