基因诊断培训课件

1、第16章 基因诊疗 王慧莲基因诊断第1页概述几乎全部疾病均在一定程度上与基因有某种联络，基因改变，或是疾病发生原因，或是疾病发生结果，或是疾病发生时伴随现象，而这些现象出现是有规律。所以，能够经过检测基因改变来反应疾病发生和发展，疗效和预后基因诊疗：是以DNA或RNA为诊疗材料，经过检验基因存在、缺点或表示异常，对人体状态和疾病作出诊疗方法和过程。基因诊断第2页基因诊疗经历了三个基本发展阶段第一阶段：世纪年代，以DNA分子杂交为基础，经过限制性片段长度多态性性（RFLP)分析进行第二阶段：应用PCR技术第三阶段：应用基因芯片技术基因诊断第3页第一节 基因诊疗基础技术一 .基因诊疗中惯用几个技术

2、（一） 核酸杂交（二） PCR（三） DNA序列测定（四） DNA芯片技术基因诊断第4页(一)核酸分子杂交技术(1)方法: 以已知次序核酸片段作为探针,经放射性或非放射性物质标识后,再与未知目标核酸片段进行杂交反应,分离已杂交和未杂交标识核酸链,经过标识信号检测就能够对未知目标核酸链进行定性、定量分析.(2)几个不一样形式核酸分子杂交 a. Southern印迹(southern blot)杂交: 用于DNA检测，可用于基因限制性内切酶谱分析，基因突变分析等 b. Northern印迹(Northern blot)杂交: 用于RNA检测，能对组织细胞中总RNA 或mRNA进行定性和定量分析 c

3、. 斑点杂交（dot blot): 既能够检测DNA也能够检测RNA,用于特定基因及其表示定性和定量分析方法简单、灵敏；但特异性低基因诊断第5页原位杂交（in situ hybridization): 是细胞学技术与核酸杂交技术结合一个核酸分析检测技术可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交,用于检测染色体中特定基因位置，用于染色体疾病诊疗 分类: 玻片原位杂交:如中期染色体和组 织切片. 膜上原位杂交:将菌落或噬菌斑影印在尼 龙膜(如硝酸纤维膜) 基因诊断第6页原位杂交镜像图基因诊断第7页(二)PCR技术在基因诊疗中应用（）等位基因特异性寡聚核苷酸（allele specific oligonn

4、ucleotide,ASO)探针斑点杂交：PCR-ASO该方法是诊疗已知点突变：需分别合成野生型和突变型探针在基因诊疗时，只需用PCR扩增受检者目标DNA片段，再分别与上述探针杂交杂交结果有以下几个情况： PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交-不 存在这种突变； 只与突变探针杂交-突变基因为纯合子； 与正常探针和突变探针都可杂交-突变基因为杂合子； 与正常探针和突变探针都不能杂交-突变基因不属于已发 现类型基因诊断第8页（）单链构象多态性（single strand conformation ploymorphism,SSCP)分析是一个基于单链DNA构象差异来检测点突变方 法DNA

5、变性形成单链，在中性条件下长度相同单 链指DNA,假如碱基组成和(或)排列次序不一样,形成 构象就不一样,这么就形成了单链构象多态性.这些分子在非变性PAGE中电泳中表现出不一样迁移率. SSCP尤其适于分析小于400bp PCR产物。据认为SSCP能够区分1bp差异PCR-SSCP分析不能确定基因变异内容，所以电泳后结果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质基因诊断第9页(3)限制性片段长度多态性（ restriction fragment length polymorphisms,RFLP）分析基因突变造成基因碱基组成或(和)次序发生改变,会在基因结构中产生新限制性内切酶位点或使原有位点消

6、失. 用限制酶对不一样个体基因组进行消化时，其电泳条带数目和大小就会产生改变，依据这些改变能够判断出突变是否存在.基因诊断第10页 限制性片段长度多态性 RFLPs ( restriction fragment length polymorphisms)样品一样品二1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP为遗传标识绘制了第一张人类遗传图谱基因诊断第11页(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术 双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而解链,造成DNA分子电泳迁移率改变.当在不一样梯度浓度变性胶中电泳时, DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA开始解链，从

7、而不一样DNA片段会形成不一样迁移率条带优点：可靠，检出单碱基突变率可达缺点：富含高熔点GC区时，则难以检测出突变基因诊断第12页（）用甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR)进行分析 在PCR扩增前，先用化学试剂（NaHSO3)处理模板DNA,将全部未甲基化胞嘧啶（C)转变成尿嘧啶(U)，在PCR扩增时，U与引物中A配对；而CpG岛上甲基化C不受影响，在扩增时仍与G配对,基于这种差异能够进行甲基化特异性PCR设计一对甲基化特异性引物（引物中G结合模板中C);和非甲基化特异性引物（引物中A结合模板中U),经过PCR扩增就可检测出甲基化等位基因化学修饰DNA序列和非

8、甲基化等位基因序列用于一些疾病和肿瘤基因诊疗基因诊断第13页(6)采取PCR技术对靶核酸进行定量分析 定量PCR(quantiative PCR, Q-PCR): 就是对靶核酸分子进行定量分析技术.根据PCR扩增指数增长久原理，理论上扩增产物累积分子数N=No(1+E),其中E是指每次循环中参与复制模板数与总模板数比率.经过N值可求出No. 但PCR扩增时平台期(15-25)出现会影响测量准确度.定量PCR策略和方法较多.n基因诊断第14页 a. 经过测定PCR产物量 方法: 对已知量靶DNA进行系列稀释,比较待测样品和已知系列稀释样品PCR产量,还可对未知量靶DNA进行绝对定量. b. 采取

9、极限稀释法对靶核酸进行定量分析: 方法:将待测DNA标本进行倍数稀释,直至扩增不到靶基因稀释度,用稀释程度表示启始靶基因分子数相对量,是一个半定量方法.基因诊断第15页 c.采取非竞争性对照法对靶核酸进行定量分析 方法:该方法是在一个试管内同时扩增来自同一DNA一段靶序列和另一段内标序列,用内标序列控制DNA用量、可扩增性和管间扩增效率改变,经过比较两段序列PCR扩增产物电泳带荧光强度,对靶序列进行定量分析 d. 采取竞争抑制法对靶核酸进行定量分析: 方法:参考标准不是同一核酸分子上另一段序列,通常是人工模板,与待测序列含有相同引物结合位点,能与待测序列竞争聚合酶,底物,引物分子. 方法:将竞

10、争模板作系列稀释后加入恒量样品DNA进行PCR扩增,经过分离和分析竞争模板和样品DNAPCR产量,对样品DNA进行定量分析基因诊断第16页 e.荧光定量PCR(FQ-PCR)技术是一个当前国内外应用较为广泛定量PCR技术,是经过始点定量和荧光检测系统实时监测累计荧光强度而实现,含有灵敏度高,特异性强等优点. FQ-PCR技术两种定量形式: 绝对定量:普通采取外标准品定量制备来实现绝对定量. 如合成目标基因;将PCR产物直接梯度稀释;或将PCR产物克隆到载体上,抽取质粒,经过测量浓度和拷贝数可准确定量.优点:稳定,准确. .相对定量:指在测定目标基因同时测定一内源性管家基因(如-actin, r

11、RNA等),该管家基因主要是用于核苷酸拷贝数比较,反应反应体系内是否存在PCR扩增影响原因.基因诊断第17页(三）DNA序列测序1977年Sanger创建链终止反应序列测序法 用放射性同位素标识引物，用双脱氧核苷酸随机终止DNA链延伸，产生长度不一样DNA片段，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影读出结果。自动测序法 采取四色荧光标识代替了放射性同位素标识。 DNA 测序测定是基因突变检测最直接，最准确方法，它不但可确定突变部位，还可确定突变性质基因诊断第18页（四）DNA芯片技术 DNA芯片（DNA chip)又称为基因芯片，DNA微阵列（DNA microarray) 该技术基础

12、依然是利用核酸分子杂交原理：首先将一系列预先设计好核酸探针（oligos or cDNA)有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成DNA微阵列。用荧光标识待测样品（DNA,cDNA,RNA)与位于芯片上核酸探针杂交后，经过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，再用特定软件对荧光信号进行综合分析，就能取得待测样品大量基因序列信息或表示信息。 基因芯片按照用途分为：表示芯片，诊疗芯片，指纹图谱芯片，测序芯片，毒理芯片等。 该技术可用于新基因判定，突变检测，表示监控和遗传制图等。基因诊断第19页第二节 对不一样疾病需要采取不一样基因诊疗策略一.经过致病基因检测诊疗疾病 已经基本

13、清楚基因突变与疾病发生之间分子机制，相关基因已被克隆，测序，并被定位在染色体上。 如：一些与疾病相关内源基因-癌基因，抑癌基因和血红蛋白基因突变型。 诊疗方法：依据突变基因序列设计探针.基因诊断第20页二.经过连锁遗传标志检测诊疗疾病 许多基因病，即使它们基因结构还没有说明，但经过染色体分析已被定位在染色体特定位置上，这些基因是经过检测与特定染色体位点连锁遗传标识来发觉。 原理：同一染色体上位置十分靠近相邻基因或其它遗传标识，在遗传过程中分离几率很低，经常一起遗传，形成连锁。能够经过一个或几个基因或遗传标识分析，了解另一个或几个基因。基因诊断第21页三.经过与疾病相关克隆建立疾病基因诊疗指标4

14、0-60年代: 功效克隆,即基于显著可见或直接与生化功效相关线索确定与疾病相关基因: 如苯丙酮尿症与镰刀型贫血病等.70-80年代:定位克隆,即基于疾病-染色体-基因反向遗传学策略对没有显著表型或生化功效异常疾病.90- 今 :表型克隆,不考虑基因在染色体上位置信息,而是直接在疾病与正常样本之间寻找分子水平上差异. 基因诊断第22页利用表型克隆诊疗疾病表型克隆：对疾病相关一组基因进行克隆 一些多基因，多原因疾病，如：肥胖，哮喘，高血压，冠心病，肿瘤，精神病，自体免疫性疾病等，因为疾病发生原因复杂，不但包括多基因互作，还包括基因与环境互作。不可能经过前面方法来诊疗，必须利用差异显示等技术找出正常

15、人和疾病患者之间差异序列，判定与疾病相关多个基因，确定造成疾病分子缺点。 方法：依据克隆到一组基因制作对应一组探针，用这组探针检测一组与疾病相关基因来诊疗多基因病基因诊断第23页第三节 遗传病基因诊疗一. 遗传病基因诊疗策略1.直接策略：采取基因突变诊疗方法，直 接检测致病基因。该策略前提是基因已被克隆. 2.间接策略：即经过检测与致病基因连锁 遗传标识进行基因诊疗.基因诊断第24页人类基因组上DNA遗传标识 限制性片段长度多态性(RFLPs )1985 短串联重复序列 (short tendem repeats, STRs ,mini- satellites )1990s 单核苷酸多态性 (

16、single-nucleotide polymor-phisms SNPs)基因诊断第25页短串联重复序列STRs (short tendem repeats, Microsatellites )STR广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是1bp-8bp串联重复，重复次数 n=15-60，已知8000多个，主要形式为： (CA)n ， (GA)n ， (AA)n ， (GG)n ， (CAA)n， (CGG)n ，其中以 (CA)n ， (GT)n 为多见。1992年，Welssenbanch等以STR为标识第二代连锁图取代了RFLP连锁图。基因诊断第26页 定义:主要是指在基因组水平上由单

17、个核苷酸变异所引发DNA序列多态性。与RFLP与STR不一样,它是直接以序列变异作为标识,而不是以片段长度差异作为标识. 人类基因组图谱初步分析表明，共有3万至3.5万个基因。有300多万个单核苷酸多态性,SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，3-4个相邻标识组成单倍型（haplotype）就可有8-16种。 1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性 标识制备第三代遗传连锁图遗传标识。单核苷酸多态性（single nucleotid polymorphism，SNP）基因诊断第27页SNP用作遗传标识含有以下优点： SNP在人群中是二等位基因性，在任何人群

18、中其等位基因频率都可预计出来。它在基因组中分布较微卫星标识广泛得多。与串联重复微卫星位点(STR)相比，SNP是高度稳定.尤其是处于编码区SNP(cSNP),而前者高突变率轻易引发对人群遗传分析出现困难。部分位于基因内部SNP可能会直接影响产物蛋白质结构或基因表示水平，所以，它们本身可能就是疾病遗传机制候选改变位点。易于进行自动化分析，缩短了研究时间 .基因诊断第28页一. 血红蛋白病基因诊疗 分为异常血红蛋白病和地中海贫血,前者是因为珠蛋白基因突变；后者是因为珠蛋白合成速率降低，a链和b链合成不平衡。（一）异常血红蛋白病基因诊疗： 如镰状红细胞贫血病:链第六位氨基酸:GAA(谷)GUA(颉)

19、代替. 对该病基因诊疗应采取: 1)PCR+限制酶切,即用PCR从患者基因组扩增含突变位点珠蛋白基因片段,再选适当内切酶消化PCR产物,依据电泳图谱上片段数量和大小做出判断 2)Southern 印迹杂交分析基因诊断第29页血红蛋白病基因诊疗2（二） 地贫基因诊疗： 1. 定性分析：PCR法直接扩增1和2 基因3端有差异，针对此可设计 引物进行PCR，如有缺失，则不能扩 增出产物 2. 定量分析:地贫共同特点是 珠蛋白mRNA量降低，所以可用 RT-PCR定量分析mRNA量以助诊疗基因诊断第30页 （三） -地贫基因诊疗 1. DN检测与分析 ： PCR+ASO 探针法 为主要方法 依据 -珠

20、蛋 白主要突变位点，设计2对引物，扩增可能发生 突变2个片段,再分别与对应野生型探针和突 变探针进行斑点杂交。 PCR+RFLP连锁分析法 检测与-珠蛋白基因连 锁遗传标识进行基因诊疗,如-珠蛋白5端 有一限制内切酶HgiAI多态性位点,在中国人 群频率为0.5 DNA芯片技术 2.RNA检测与分析：RT-PCR定量分析mRNA量以助诊 断基因诊断第31页二.杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)DMD：是性连锁隐性遗传病,是由抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因突变(突变或缺失). 其突出特点为横纹肌进行性萎缩，引发无力和挛缩。DMD相对更为常

21、见。DMD患儿在5岁前发病，20岁左右因为心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，发病率在男性活婴中约1/3500 。基因诊断第32页杜氏肌营养不良症基因诊疗RFLP连锁分析:经过家系连锁分析,找出与突变基因相连锁DNA多态性,并将其作为遗传标识追踪多态性在家族组员中传递.基因组DNA探针法: 用突变高发区常见序列作为探针,检测抗肌萎缩蛋白基因对应变异.cDNA探针法:用较短抗肌萎缩蛋白基因cDNA作为探针.比2方便、检出率高.多重PCR法:对基因突变较集中区域,设计多对引物,扩增基因对应突变高发区,检测对应基因突变.基因诊断第33页第四节 用基因诊疗技术检测肿瘤 肿瘤发生包括多个基因、各种原因、发生过程呈

22、多阶段性、发生分子机制十分复杂,所以对不一样肿瘤要采取不一样基因诊疗策略.一.经过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊疗肿瘤淋巴造血系统肿瘤: 染色体易位及基因融合是较普遍现象. 如:淋巴瘤和淋巴结反应性增生.它是因为T细胞受体(TCR)基因和IgH基因重排,使原来相隔数百个碱基IgH和TCR基因V区和J区靠近在一起.用PCR扩增该区域片段,经过长度分析就能判断是否发生了基因重排. 基因诊断第34页二.经过检测癌基因和抑癌基因诊疗肿瘤 癌基因激活及抑癌基因失活与肿瘤发生亲密相关.大多人类肿瘤组织或细胞中都能检测到癌基因和(或)抑癌基因突变1.癌基因-ras与肿瘤: ras是肿瘤中最常被激活癌基因.激

23、活分子机制主要是点突变,高发区是第12 、13和61位密码子.如90%胰腺癌,50%结直肠癌和1/3肺腺癌都在是K-ras基因第12位密码子突变. ras癌基因点突变检测方法: a.PCR-ASO法:检测速度快，灵敏度高，检测样品量大等优点； 但点突变检出仅限于寡核苷酸探针探测位点和突变类 型。 b.PCR-SSCP法：依据PCR扩增目标DNA片段在非变性凝胶电泳中迁移率，将突变基因检测出来。该法检测点突变更方便； 缺点：不能检测出突变详细位点和详细类型。基因诊断第35页经过检测癌基因和抑癌基因诊疗肿瘤（续） 2 .P53基因与肿瘤：p53基因是最常被失活抑癌基 因，失活分子机制主要是基因突变

24、，也有因为基 因表示异常而使p53失活，约50%以上恶性肿瘤有 p53基因突变。 突变类型：130290密码子间常发生点突变，也有少许插入或缺失突变。 基因检测方法： PCR-SSCP:可检出有没有突变 PCR-RFLP:经过内切酶位点消 失或增加检测p53基因突变。基因诊断第36页三.经过检测肿瘤相关病毒诊疗肿瘤 已经发觉各种病毒与肿瘤发生相关，它们有DNA病毒，也有RNA病毒,其中逆转录病毒(retro-virus)对动物细胞致瘤作用已得到公认.还发觉一些与人肿瘤发生相关病毒如: Burkitt 淋巴瘤人类乳头瘤病毒(HPV)宫颈癌经过检测这些病毒基因就能够帮助诊疗对应肿瘤.EB病毒基因诊断第37页四.经过检测肿瘤标识物基因或mRNA诊疗肿瘤肿瘤标志物（tumor marker)是由肿瘤组织细胞产生，与肿瘤形成和发展相关物质，包含：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。仅存在肿瘤细胞中。 类型：基因标志：是指基因本身突变和异常表示，能反应癌前开启阶段改变。基因表型标志：基因产物表示和调控异常，表现为所编码表示产物合成紊乱，产生胚胎性抗原，普通出现较晚。 基因诊疗方法： 基因变异造成肿瘤标识物产生或含量改变，可选择：PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-测序，PCR-SSCP等技