中科大【生物化学与分子生物学实验原理】Westen+blot

1、实验十 Western blot 法鉴定目的蛋白的表达及表达量大小 李卫芳张钧玮实验目的：1.1 掌握Western blot的实验原理；1.2 掌握干（湿）转移槽的使用和转膜的基本操作程序。2. 实验原理：通过电泳区分待测样品不同的组分，再在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白。了解转膜电泳原理的应用及操作Western Blotting or immunoblotting a

2、specific primary antibody1979, Towbin1975, Southern, Southern blotting1977, Alwine, Northern blotting1979, Towbin, Western Blotting 1982, Reihart, Eastern blotting ,双向蛋白质印记Western blot analysis can detect one protein in a mixture of any number of proteins while giving you information about the size

3、of the protein. It does not matter whether the protein has been synthesized in vivo or in vitro. Samples are prepared The sample is separated using SDSand then transferred to a membrane The membrane is incubated with a generic protein (such as milk proteins) to bind to any remaining sticky places on

4、 the membrane. A primary antibody is then added to the solution which is able to bind to its specific protein A secondary antibody-enzyme conjugateprocedureWestern blotting: Antibodies can be used to detect specific proteinsMemebrane: 吸附生命大分子的固体材料NC, nitrocellulose 硝酸纤维素膜 0.45um 结合率：80150 ug Pr/cm2

5、便宜，可简单快速封闭非特异性抗体的结合NDM, nylon-densed membrane 尼龙膜 结合率：480 ug Pr/cm2 难以染色，多用于核酸转移PVDF（Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜）： 多用于蛋白质测序DBM, diazobenzyloxymethyl 重氮苄氧甲基膜platinum-coated titanium plate as the anode and a stainless-steel plate as the cathode湿法转移蛋白质：将gel 和membrane 夹在blotter paper 中，浸在转移装置的buffer

6、中，通电45min 或over night 可完成。Transfer Buffer (500 ml, pH 8.3) glycine 1.450 g (39 mM) Tris base 2.900 g (48 mM) SDS 0.185 g (0.037%)CAPS Buffer 适合转膜，可用于氨基酸测序高浓度的甘氨酸会干扰测序Using the Semi-Dry Transfer Unit Remove the stacking gel from the gel. 2.Cut pieces of blotter paper to the size of the gel. note: the

7、 blotter paper (and the membrane) not be larger than the gel. Larger pieces may make contact around the gel, and allow the current an alternate route, thereby making transfer inefficient. 3. Wearing gloves rinsed of powder, cut a piece of membrane to the size of the gel. Mark the lower right-hand co

8、rner to allow for orientation. Pre-wet the membrane （gel，blotter paper) in transfer buffer for 2 to 5 minutes. 4. sandwich blotter paper membrane- gel- blotter paper make sure no air bubbles are trapped The membrane must therefore be positioned correctly the first time. Do not try to adjust.5. Hold

9、the cover level and slide it gently down onto the stack. 6. weigh down the lid in order to ensure even contact with the stack. 7. Connect the unit to a suitable power supply. Turn the power supply to zero before turning on. Turn on the power supply. Larger gels must be limited to 0.8 mA/cm2 to avoid

10、 excessive heat build up. 8 mm x 7 mm mini-gels at 100 mA. Molecular WeightTransfer Period80,00045 minutesProblem：蛋白质转移效率低？（转移后对凝胶或膜染色进行观察）transfer buffer中加入20甲醇或加入终浓度为0.1%SDS, 可增加转移大的蛋白质的能力；使用小孔径的硝酸纤维素膜转移后的膜在含0.2%戊二醛的TBS中浸泡45min。3.3 转移（实验中取胶和膜需带手套） 膜的选择：印迹中常用的固相材料有硝酸纤维素（NC）膜、尼龙膜、聚偏二氟乙烯（PVDF）等。我们硝酸纤

11、维素膜。 A 半干法 即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。1 实验条件的选择电流1 -2 mA/cm2，我们通常100 mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。 Bio Rad 半干电转移槽 （Trans-Blot Transfer Cell）2 实验操作 （1）滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。A. 检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。C.

12、 将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再转入transfer buffer中。D. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。（2）转移A. 在电转移仪上铺好下层滤纸，一般用三层。B. 将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的湿润。C. 将胶剥出，去掉stack gel，小心地移到膜上。D. 再铺三张滤纸覆盖在胶上。倒上些transfer buffer，用玻棒赶走气泡。F. 联通电转移仪，根据需要选定合适的电流和时间。G. 转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。 Bio Rad Trans-Blot

13、Plus Cell1染胶 用考马斯亮兰染色，经脱色液脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。2染膜 有两类染液选择，可逆的和不可逆的。不可逆的染料，如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。可逆的有丽春红染色液（ponceau-s red）、Fastgreen FC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。将薄膜漂在ponceau-s red中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。丽春红S (Pon

14、ceau S dye)， 染色后可继续进行免疫检测 灵敏度低氨基黑印度墨水生物素增强胶体金膜总蛋白质染色12泳道进行膜总蛋白质染色检测转移效率3.4 封闭（block） 封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。 常用的封闭液有bovine serum albumin(BSA，non-fat milk，casein，gelatin，tween-20等，我们一般用BSA。 在转移结束前配好1%的BSA(TBST溶解)。转移结束后将膜放入BSA中block(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。 Block 4 0C O/N

15、，或 RT 1小时。洗涤 用 TBST先快速洗两次次，把BSA尽快的wash掉。再用TBST洗10mins * 3。3.5 孵育一抗A.先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。B.按要求稀释好抗体（1:2000）。注意，如需高比例稀释，最好采用梯度稀释。C.将稀释好的抗体和膜一起孵育。 一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。注意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育。洗涤用 TBST洗，5min * 2，10min * 3。洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。

16、3.6 孵育二抗孵育 RT 1 小时。 一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:3000。二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者标志其他探针（如核素等）的。洗涤 用TBST 快速洗两次，然后10min * 3。洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。免疫检测辣根过氧化物酶（HRP）：1020pg碱性磷酸酶（AP）：1050pg 3.7 显色及曝光化学发光底物：稳定型过氧化物溶液和鲁米诺/增强溶液原理：在HRP催化作用下，过氧化物（H2O2）与Lumino